血液分析仪与手工计数法在实验树鼩红细胞生理指标检测中的效果评价

冯清源,冯一唯,夏 巍,戢克铜,陈泓霖,赖永静,唐安洲

(广西医科大学第一附属医院,南宁 530000)

树鼩是一种小型哺乳类动物,在我国云南、广西、贵州、海南等地均有分布[1]。 树鼩具有体型小、易饲养、繁殖周期短、管理便捷等特点,在解剖结构,生理功能与生化代谢方面与人类有诸多相似之处[2-3],并且全基因组测序结果证实了树鼩与灵长类动物具有高度亲缘关系[4]。 基于这些优势,近年来树鼩作为实验动物被广泛应用于生物医学领域,并取得了丰硕的成果[5-8]。

目前有关树鼩的研究多为应用型研究,较少见有关于树鼩自身生理指标测量方面的报导,随着树鼩的广泛使用,其正常生理指标的系统化和标准化将变得至关重要。 血常规检查简便、快捷,对机体内许多病理改变都有敏感反映[9-12],是动物造模中最常用的检查指标之一。 虽已有学者对实验树鼩的血象进行了初步研究[13-20],但尚未见有通过手工法对树鼩红细胞相关生理值进行测定的报导,同时由于不同研究中使用的血细胞分析仪型号和厂商不同,导致分析系统的原理和方法不尽相同,而使得不同的研究结果之间一致性较差,例如:马旭通等[19]使用美国雅培CELL-DYN3700 全自动血球分析仪测量的人工繁育树鼩红细胞数量(1012/L)和血红蛋白含量(g/L)分别为(7.99±0.92)和(149.2±15.5)；而李进涛等[20]利用贝克曼库尔特DifF-2 型全自动血细胞分析仪测量中缅滇西亚种树鼩的结果分别为(9.8±0.6)和(174.8±11.04)；而白继丽等[18]利用BC-2800Vet 全自动血液细胞分析仪测量人工饲养树鼩的结果为(8.21±0.96)和(150.12±13.60)。 以上研究中树鼩的种属来源有一定差异,此外,马旭通等[19]测量了野生树鼩不同性别红细胞数量,结果分别为(7.93±0.59)(雌)、(6.97±2.15)(雄),因此,树鼩种属来源以及性别的不同也可能是导致研究结果差异的影响因素。 同时,血液分析仪较手工法测量血液生理指标有可能存在一定误差,2012 年,Zandecki 等[21]详细分析了血液分析仪的误差可能,脂质、凝集素、冷球蛋白和白细胞计数升高等会导致血红蛋白测量或红细胞计数异常,这些测量指标的异常同时可能导致计算出的平均红细胞指数也受到影响。 为了对血细胞分析仪测定结果的准确性进行分析,本研究对实验室繁殖树鼩外周血中红细胞生理值指标数值进行了手工检测,并与不同血液细胞分析仪的结果进行对比,旨在为今后的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级成年中缅树鼩滇西亚种20 只,雌雄各半,体重为120～130 g 之间,由昆明医科大学实验动物中心提供[SCXK(滇)K2019-0005],在广西医科大学实验动物中心[SYXK(桂)2014-0003]稳定4周以上。 普通级树鼩饲养房,单笼喂养, 室内温度(24±1)℃,相对湿度40%～50%,人工光照12 h/d。每日上午10 点清理粪便并投喂全营养颗粒饲料及谷物,隔天投喂水果, 每周投喂面包虫1 次,自由正常饮水。 实验时处于树鼩非繁殖期。 实验动物的使用经过广西医科大学动理伦理委员会的批准(20190921),实验过程中按照3R 原则给予实验动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

使用迈瑞BC-6800 型全自动血液细胞分析仪(迈瑞,深圳)和优利特URIT-3010 型全自动血细胞分类计数仪(优利特,桂林)进行血液细胞分析测定,检测试剂为原装配套试剂。 血红蛋白测试液、游离血红蛋白测试盒均购自南京建成生物工程研究所；BX53F 正置光学显微镜(奥林巴斯,日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 血样的采集

禁食12 h 后将树鼩置于专用的树鼩保定袋中固定,清醒状态下经股静脉抽取2 ～2.5 mL 全血,采血时间控制在30 s 以内,动作轻柔,尽量避免溶血。将收集到的血液置于含有EDTA 抗凝剂的采血管中并混匀,同时取4 μL 血于干净载玻片上,制备薄厚适宜且细胞分布均匀的血涂片。

1.3.2 检测方法

严格按照标准操作程序使用迈瑞BC-6800 型全自动血液细胞分析仪和优利特URIT-3010 型全自动血细胞分类计数仪测定血液细胞,得到包括红细胞数(RBC)、血细胞比容(HCT)、血红蛋白含量(Hb)、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)等血液生理指标。 手工法测量血细胞比容原理为微量比容法,红细胞直径的测量和红细胞计数；使用正置光学显微镜及其配套软件进行血涂片镜检；血红蛋白含量、游离血红蛋白(FHB)含量检测使用南京建成生物工程研究所生产试剂盒通过HICN 比色法测得。

1.4 统计学方法

用SPSS 25.0 软件包分析数据,各项数据均以“平均数±标准差”()表示,参考值范围的计算方法则根据数据是否正态分布决定,若符合正态分布,则进一步计算中位数(median) 和95% CI(confidence interval,置信区间),统计判断:正态分布数据采用t 检验,非正态分布数据采用秩和检验,P＜0.05 被认为具有统计学差异。 采用Medcalc 7.0 和GraphPad Prism 7 统计分析软件绘制Bland-Altman 图和Passing-Bablok 回归分析,评估两种方法的一致性。基于Passing-Bablok 回归分析所获得的截距和斜率来判断方法的一致性:若截距和斜率的95%置信区间(CI)分别包括0 和1,则两方法一致性好；若截距和斜率的95%置信区间(CI)未分别包括0 和1,则两方法一致性差。 基于Bland-Altman 图上的点在一致性界限(limits of Agreement, LoA)的分布情况,均匀分布于Y=0 的两侧,判断两种方法是否存在系统差异；基于两方案总体平均差、总体截距和斜率的95%CI 是否包括0,判断两种方法是否存在比例差异。

2 结果

表1 记录了树鼩外周血中红细胞数、血细胞比容、血红蛋白含量、红细胞平均容积、红细胞平均血红蛋白含量、红细胞平均血红蛋白浓度的手工法和血液细胞分析仪的测量结果。 手工法中红细胞平均容积、红细胞平均血红蛋白含量和红细胞平均血红蛋白浓度依据所测得红细胞数、血细胞比容和红细胞平均血红蛋白浓度的结果结合公式计算得来。可见手工法和五分类血液细胞分析仪的结果中仅有血细胞比容和红细胞平均血红蛋白含量无统计学的差异,其余各项指标均存在统计学差异；三分类血液细胞分析仪的结果仅有红细胞计数一项与手工法结果之间无统计学差异,其余各项指标均存在统计学差异。 图1 和图2 以Bland-Altman 图和Passing-Bablok 回归分析评估了手工法和血液细胞分析仪两种方法的一致性,结果显示在使用五分类血液细胞分析仪检测HCT 和MCH 时,Bland-Altman图上的点分布于Y=0 的两侧且总体平均差、总体截距和斜率的95%CI 均包括0,同时Passing-Bablok 回归分析截距和斜率的95%CI 分别包括0 和1,因此两种方法之间无显著统计学差异,且方法之间一致性好,不存在系统误差和比例误差；在检测红细胞数、Hb、MVC、MCHC 时,Bland-Altman 图上的点较为均匀分布但偏向于Y=0 上侧或下侧,且部分参数的总体平均差、总体截距或斜率的95%CI 不包括0,Passing-Bablok 回归分析截距的95%置信区间(CI)不包括0 或斜率的95%置信区间(CI)不包括1,因此两种方法之间的一致性一般,存在较大的系统差异和一定的比较差异,提示使用五分类血液细胞分析仪进行检测时仅能对上述指标变化趋势进行判断；三分类血液细胞分析仪的检测结果中,红细胞数与手工法比较,Bland-Altman 图上的点均匀分布于Y=0 的两侧且总体平均差、总体截距和斜率的95%CI 包括0,同时Passing-Bablok 回归分析截距和斜率的95%CI 分别包括0 和1,无系统差异和比例差异,但其余各项指标均存在较大的系统差异和比例差异,提示该型仪器的检测结果与真实值之间存在较大差异。 手工法检测树鼩外周血中游离血红蛋白的测量结果为(79.27±6.95),95%CI 为76.02～82.52,有一定参考意义。 图3 使用正置光学显微镜及其配套软件对血涂片上合适区域的树鼩红细胞直径进行检测得到外周血红细胞直径曲线,可见直径在5.5～6 μm 之间的红细胞最多,偶见过大或过小的红细胞。

表1 手工法与血细胞分析仪检测树鼩红细胞生理值结果Table 1 Manual counting and hematology analyzer method to measure the physiological indexes of tree shrew erythrocytes

3 讨论

本研究使用手工法及仪器法分别对树鼩外周血红细胞数、血细胞比容、血红蛋白含量、红细胞平均容积、红细胞平均血红蛋白含量、红细胞平均血红蛋白浓度指标进行测量比较,手工法测定得到的红细胞数、血红蛋白含量介于三分类仪器法和五分类仪器法之间,高于三分类而低于五分类。 手工测量血细胞比容使用微量离心法,与本文五分类全自动血液分析仪测定的数据比较来看,数值较为接近,无显著差异(P=0.104)。 测量过程中血浆渗透压的改变对血细胞也会有一定影响[22]。 血细胞比容能够反映出红细胞与血浆容量的相对关系,故而血浆容量对其有明显影响,红细胞体积也有一定的影响。 由于所检测的红细胞数量多,血细胞比容有可能受到血浆容量发生改变及红细胞体积的变化而有所差异。 手工法与五分类仪器法测得数据中红细胞数、红细胞平均容积、红细胞平均血红蛋白浓度及血红蛋白含量差异有统计学意义(P ＜0.001)；手工法与三分类仪器法测得的数据中血细胞比容、红细胞平均容积、红细胞平均血红蛋白含量红细胞、平均血红蛋白浓度及血红蛋白含量差异有统计学意义(P＜0.001)。 本研究中所使用的优利特血细胞分析仪采用电阻抗的原理对红细胞及血小板进行计数,而迈瑞血细胞分析仪是采用电阻抗加激光的原理。 当血细胞通过计数孔时会产生脉冲信号,而脉冲数量与细胞数量呈正比、脉冲的高度与通过其的血细胞体积的大小成正比[23],通过将脉冲的高度叠加换算得到血细胞比容,因此仪器并不能区分不同血细胞之间的理化性质[24],对于小体积红细胞和血小板计数易混淆,导致出现误差。 同时,不同物种之间正常血细胞及蛋白的特性有一定差异,如正常人外周血红细胞直径在6～8 μm 之间,对比手工法测量的树鼩红细胞直径(图3),正常人红细胞直径略大于树鼩,在使用未经过数据校正的血液分析仪对树鼩外周血进行检测时可能存在一定的偏差,针对这些差异,在使用血液细胞分析仪时应进行参数的调整。 并且,手工法在显微镜下针对细胞及特殊成分的计数依然是最可靠的检查方法[25],应结合手工法的结果对血液细胞分析仪的参数进行适当的调整。

同时,本文还首次使用手工法测量了树鼩外周血中游离血红蛋白的含量,游离血红蛋白能够提示红细胞的溶血情况,溶血程度对于其相关生理指标的检测有明显影响,游离血红蛋白含量对于红细胞及血红蛋白相关指数的测量准确性有较好的提示作用,能够为未来进一步研究提供参考。 红细胞平均指数由血细胞比容、血红蛋白量及红细胞计数间接计算得出,为避免误差,本文手工法测定这三个指标使用同一份抗凝血标本。 无论手工法或仪器法,都应注意尽可能避免发生溶血。

图1 Bland-Altman 图的x 轴表示手工法与血液细胞分析仪的平均值,y 轴表示两种方法结果之间的差异Note.Manual counting and BC-6800, RBC,MCH, The points on the Bland Altman are distributed on both sides of Y=0,and the 95% CI of the total mean deviation, total intercept and slope includes 0.HCT, Hb, MVC, MCHC, The points on the Bland Altman are more evenly distributed but tend to the upper or lower side of Y=0, and the 95% CI of the overall mean deviation, overall intercept or slope of some parameters does not include 0.Manual counting and UNIT-3010, RBC, The points on the Bland Altman are distributed on both sides of Y=0, and the 95% CI of the total mean deviation, total intercept and slope includes 0.HCT, Hb, MVC, MCH, MCHC, The points on the Bland Altman are more evenly distributed but tend to the upper or lower side of Y=0, and the 95% CI of the overall mean deviation, overall intercept or slope of some parameters does not include 0.Figure 1 The x-axis of Bland Altman graph represents the average value of manual method and hematology analyzer, and the y-axis represents the difference between the results of the two methods

图2 Passing-Bablok 回归分析显示了手工法与细胞分析仪获得的数据之间的一致性Note.Manual counting and BC-6800.RBC,MCH,95% CI of intercept and slope of Passing-Bablok regression analysis includes 0 and 1 respectively.HCT, Hb, MVC, MCHC, The intercept 95% CI of Passing-Bablok regression analysis does not include or the slope 95% CI does not include 1.Manual counting and UNIT-3010, RBC, 95% CI of intercept and slope of Passing-Bablok regression analysis includes 0 and 1 respectively.HCT, Hb, MVC, MCH, MCHC, The intercept 95% CI of Passing-Bablok regression analysis does not include or the slope 95% CI does not include 1.Figure 2 Passing-Bablok regression analysis shows the consistency between the data obtained by manual method and cell analyzer

本研究选用健康成年树鼩20 只, 清醒状态下空腹股静脉采血,并及时处理所得样本, 所选用仪器均有质量控制保证,其测定结果有一定参考意义。 所有样本结合传统血涂片法并进行显微镜下分类计数。 综上所述,采用电阻抗加激光为原理的五分类全自动血液分析仪测定红细胞相关指标具有准确、快速、可靠的优点,适用于对大批量标本进行快速有效的检测,但是其并不能完全替代人工镜检法,只有两者结合应用才能保证检验结果的准确性和可靠性；单纯以电阻抗为原理的三分类全自动血液分析仪的检测结果与真实值有较大差异,应针对树鼩进行相关参数的校正。

图3 树鼩外周血红细胞直径曲线Note.The diameter of red blood cells in the right area of the blood smear was measured under an optical microscope using software.Figure 3 Diameter curve of peripheral blood erythrocytes in the tree shrew