参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注期间的心电图演变过程的影响及作用机制研究

邓凤珠,冯 冲,李春富,符海燕,李天发

(1.海南西部中心医院心电图室, 海南 儋州 570125； 2.海南西部中心医院心内科, 海南 儋州 570125；3.中山大学附属第一医院心内科, 广州 510080)

缺血性心脏病是临床常见心血管疾病,其发病率和致死率均较高,临床常见为急性心肌梗死、冠心病、心绞痛等[1]。 缺血性心脏病早期再灌注是其治疗的重要手段之一,但在心肌恢复血流灌注过程中常出现继发性损伤,易发生室性心动过速( ventriculartachycardia, VT )、 心 室 颤 动(ventricularfibrillation,VF)等并发症,是导致缺血再灌注期间患者猝死的重要原因[2-3]。 因此,寻找毒副作用少、疗效稳定的药物对减少心肌缺血再灌注损伤有重要意义。 参附注射液由中药红参、黑附片提取配置而成,具有改善微循环、提高机体缺氧耐受能力的作用。 目前,临床已有关于参附注射液对心肌缺血再灌注损伤及心肌保护作用的报道[4],但关于其对心肌缺血再灌注损伤期间心电图变化的影响及调控机制研究尚少。 本研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型,探讨参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注期间的心电图演变过程的影响及作用机制,为参附注射液临床合理用药提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠,50 只,10 周龄,体重200～240 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2018-0001]；动物饲养于中山大学[SYXK(粤)2019-0209]；实验研究过程中做到了替代、减少、优化的3R 原则,实验经中山大学实验动物伦理委员会审批(IACUC20180901-1)。

1.2 主要试剂与仪器

参附注射液(华润三九(雅安)药业有限公司,国药准字Z51020664,规格10 mL,货号180621)；TUNEL 检测试剂盒(美国Roche 公司, 货号:1884817)；逆转录试剂盒(日本TaKaRa 公司,货号:D6110A)；二喹啉甲酸(diquinolinicacid,BCA)蛋白定量分析试剂盒(美国Thermo 公司,货号:23227)；兔抗鼠蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylatedAkt,p-Akt)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(phosphorylatedGSK-3β,p-GSK-3β)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapain target protein,mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)多抗(一抗,美国Abcam 公司, 货 号: ab38449、 ab8805、 ab93926、 ab75745、ab141405、ab109268)；山羊抗兔Akt、GSK-3β、mTOR、p-mTOR 单抗(二抗,英国Abcam 公司,货号:ab8933、ab32391、ab2732、ab84400)。 ECG-6511 型心电图仪(上海光电医用电子仪器有限公司)；TK77-TKr-200C型小动物呼吸机(北京中西远大科技有限公司)；3550UV 酶标仪、7500 实时荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司)；电泳仪、CheniDocXRS 化学发光成像分析系统(美国Bio-rad 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及给药方法

取50 只大鼠,按体重排序随机分为5 组:假手术组、模型组、参附低、中、高剂量组,各10 只；假手术组:左冠状动脉前降支穿线、不接扎,穿线前10 min 股静脉推注2 mL/100 g 注射用生理盐水；模型组:缺血前10 min 股静脉推注2 mL/100 g 注射用生理盐水；参附低、中、高剂量组分别在缺血前10 min股静脉推注1、2、4 mL/100 g 参附注射液。

1.3.2 心肌缺血再灌注模型制备

术前12 h 禁食不禁水,以1 g/kg 腹腔注射20%乌拉坦进行麻醉,仰卧位固定大鼠,连接动物呼吸机,给予正压通气(呼吸频率55～60 次/分、潮气量2 mL/100 g)；针式电极固定于四肢,连接心电图仪检测标准肢体Ⅱ导联心电图,弃去心电图异常者；于左胸第三、四肋间做纵向切口,暴露心脏,用6-0 缝合线从左心耳根(左冠状动脉前降支)穿过,将直径2.0 mm 的硅胶管防止于缝合线下方,除假手术组外,其余各组均立即结扎,以心电图出现ST 弓背向上型抬高、QRS 波变宽振幅加大,提示结扎成功。结扎30 min 后进行持续再灌注90 min,全程心电检测,记录Ⅱ导联心电图(50 mm/s、增益1 mV=10 mm)及VT、VF 心律失常发生情况。 除模型组、参附低剂量组各有1 只大鼠死亡外,其余均造模成功。

1.3.3 心肌细胞凋亡测定

采用TUNEL 法检测各组心肌细胞凋亡情况。灌注结束后立即取大鼠心脏组织,切取冠状动脉前降支全层,放置于10%中性甲醛中,经过脱水、包埋后,用切片机切成厚度为4 μm 的切片,后经脱蜡、水化,PBS 洗涤晾干,加入蛋白酶K 溶液孵育20 min,PBS 再次洗涤晾干,每张TUNEL 检测液50 μL,37℃避光孵育60 min,PBS 洗涤3 次后,滴加抗荧光淬灭封片液50 μL,盖上盖玻片,于显微镜下观察细胞染色情况,每张切片随机取5 个视野,以细胞染色为棕色或棕红色判定为阳性细胞,凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.3.4 心肌组织中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、mTOR、p-mTOR 蛋白表达水平检测

取大鼠心脏冠状动脉前降支部分组织,液氮中研磨后,加入0.5 mL 细胞裂解液,冰上孵育30 min,4℃12000 r/min 离心10 min(离心半径10 cm),收集上清液,BCA 法进行蛋白定量,取40 μg 样本进行SDS-PAGE 分离,电转仪电转1 min,加入封闭液摇床封闭2 h,TBST 洗涤10 min×3 次,加入稀释一抗,Akt (1 ∶500)、p-Akt (1 ∶500)、GSK-3β (1 ∶1000)、p-GSK-3β (1 ∶500)、mTOR (1 ∶1000)、p-mTOR (1 ∶500),4℃孵育过夜,加入稀释二抗(1 ∶10000),常温孵育2 h,于暗室中曝光、显影,用凝胶成像系统扫描并用Image J 图像分析软件进行灰度值分析,以目的蛋白与内参β-actin 灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据,计量资料以平均数±标准差()表示,多样本计量资料比较采用单因素方差分析,两两样本比较采用SNKq 检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。 多组间计数资料采用整体卡方检验,两两比较检验水准α′需校准,α′ = α/[k×(K-1)/2],其中k 为组数,α=0.05。

2 结果

2.1 心肌缺血再灌注不同时间点心电图ST 段变化比较

缺血前各组心电图ST 段比较差异无统计学意义(P＞0.05),缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 各组心电图ST 段比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；与假手术组比较,模型组缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心电图ST 段明显抬高(P＜0.05)；与模型组比较,参附低、中、高剂量组缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min心电图ST 段明显降低(P＜0.05)；与参附低、中剂量组比较,参附高剂量组缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心电图ST 段明显降低(P＜0.05)；参附低剂量组与中剂量组缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心电图ST 段比较无明显差异(P＞0.05)。 见表1。

2.2 心肌缺血再灌注后VT、VF 发生率比较

缺血30 min 及再灌注90 min 期间假手术组大鼠均无VT、VF 发生；模型组及参附低、中、高剂量组缺血30 min 及再灌注90 min 期间VT、VF 发生率比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)；缺血30 min 参附中、高剂量组VT、VF 发生率均低于模型组(P ＜0.01)；再灌注90 min 参附高剂量组VT、VF 发生率均低于模型组(P＜0.01)。 见表2。

2.3 心肌细胞凋亡指数比较

假手术组、模型组及参附低、中、高剂量组心肌细胞凋亡指数分别为(1.18±0.36)%、(58.34±6.20)%、 (47.21 ± 5.32)%、 (41.60 ± 5.13)%、(35.46±4.57)%,心肌细胞凋亡指数组间比较,差异有统计学意义(F=202.286,P＜0.001)；与假手术组比较,模型组心肌细胞凋亡指数升高(t=29.195,P＜0.001)；与模型组比较,参附低、中、高剂量组心肌细胞凋亡指数均降低(t=4.087、6.054、9.224,P＜0.001)；与参附低剂量组比较,参附中、高剂量组心肌细胞凋亡指数均降低(t = 2.339、5.180,P =0.032、＜0.001)；与参附中剂量组比较,参附高剂量组心肌细胞凋亡指数降低(t=2.826,P=0.011)。见图1。

2.4 心肌组织中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、mTOR、p-mTOR 蛋白相对表达量比较

心肌组织中p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相对表达量组间比较,差异均有统计学意义(P ＜0.05)；与假手术组比较,模型组p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相对表达量均升高(P＜0.05)；与模型组比较,参附低、中、高剂量组p-Akt、p-GSK-3β 及pmTOR 蛋白相对表达量均降低(P＜0.05)；与参附低剂量组比较,参附中、高剂量组p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相对表达量均降低(P＜0.05),且参附高剂量组低于参附中剂量组(P＜0.05)。 心肌组织中Akt、GSK-3β、mTOR 蛋白相对表达量组间比较,差异无统计学意义(P＜0.05)。 见图2A、图2B。

表1 心肌缺血再灌注不同时间点心电图ST 段变化比较Table 1 Comparison of changes in ST segment of myocardial ischemia reperfusion at different times

表2 心肌缺血再灌注后VT、VF 发生率比较(%)Table 2 Comparison of the incidence of VT and VF after myocardial ischemia and reperfusion

图1 TUNEL 染色检测心肌细胞凋亡情况Note.A, Sham operation group.B, Model group.C, Shenfu low dose group.D, Shenfu middle dose group.E, Shenfu high dose group.Figure 1 TUNEL staining to detect myocardial apoptosis

图2 心肌组织中蛋白表达Note.A, Western blot electrophoresis.B, Quantitative analysis of protein in myocardial tissue.Compared with sham group, aP＜0.05.Compared with model group, bP＜0.05.Compared with Shenfu low dose group, cP＜0.05.Compared with Shenfu middle dose group, dP＜0.05.Figure 2 Protein expressions in myocardial tissue

3 讨论

临床中缺血性心脏病以血管再通术为主要治疗手段,但治疗过程中往往存在心肌缺血再灌注损伤,易引发心肌出现一系列病理性改变,表现为心肌收缩功能异常、细胞超微结构改变、心肌无复流等现象[5-6]。 引起心肌缺血再灌注损伤机制十分复杂,可能与炎症细胞浸润、自由基生成、钙离子超载及心肌细胞凋亡等多方面有关。 研究显示,心肌缺血后,患者心电图ST 段异常抬高程度与疾病严重程度呈正相关[7],应用心电图演变过程评价心肌缺血再灌注损伤的变化有重要意义。 目前,中药在治疗心肌缺血再灌注损伤方面具有多靶点、多层次、整体论治等多种优势,已成为临床研究的热点[8-9]。参附注射液方源“参附汤”名方,在缺血再灌注损伤的保护方面具有确切作用[10],通过心电图演变过程评价参附注射液对心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤的改善作用有重要意义。

本研究发现,与假手术组比较,模型组缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心电图ST段明显抬高,说明心肌缺血再灌注大鼠造模成功。应用不同剂量参附注射液干预后,大鼠缺血及再灌注不同时间点心电图ST 段明显降低,且存在剂量依赖性,缺血后30 min 参附中、高剂量组VT、VF 发生率均低于模型组,提示参附注射液可有效改善心肌缺血再灌注损伤心电图变化,降低心律失常发生率。 进一步进行TUNEL 染色发现心肌细胞凋亡指数与心电图ST 段趋势一致,证实参附注射液可有效抑制心肌细胞凋亡。 参附注射液由红参、黑附片提取液制备而成,红参具有活血化瘀、益气安神的功效,红参中含有人参皂苷Rg、Rb,具有较强清除氧自由基[11]；附片具有扩张血管尤其是对冠脉具有较强的扩张作用[12]。 参附注射液中红参与黑附片共同作用,在扩张血管的同时清除氧自由基,发挥抑制心肌细胞凋亡的作用。

此外,本研究中,模型组心肌组织中p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR 蛋白相对表达量均高于假手术组；与模型组比较,参附低、中、高剂量组心肌组织中p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR 蛋白相对表达量均降低,且呈剂量依赖性,提示参附注射液对心肌缺血再灌注损伤的改善作用可能与抑制Akt/GSK-3β 信号通路激活有关。 缺血再灌注损伤是导致细胞凋亡的主要原因,Akt/GSK-3β/mTOR 信号通路是介导细胞凋亡的重要通路[13-14]。 Akt 在缺血后再灌注早期则处于激活状态,其上游PI3K 受到胞外信号刺激后,介导Akt分子发生膜转位,继而磷酸化激活进入细胞内,继而将信号传递至mTOR 启动靶点TOR 复合体1,激活后的mTOR 参与心肌细胞凋亡过程[15-16]。 本研究应用的参附注射液含有红参提取液,红参属于益气活血养阴类中药,已有研究证实此类中药具有改善心肌缺血再灌注损伤、调节PI3K/Akt 信号通路的作用。 由此可知,参附注射液对心肌缺血再灌注损伤的改善作用可能与抑制Akt/GSK-3β 信号通路激活有关。

综上所述,参附注射液可有效改善心肌缺血再灌注损伤心电图变化,降低心律失常发生率,抑制心肌细胞凋亡,可能与抑制Akt/GSK-3β 信号通路激活有关,为参附注射液的临床应用提供理论支持,但关于参附注射液是否存在其他调控通路改善心肌缺血再灌注损伤有待进一步研究。