BALB/c 突变卷毛小鼠肝癌移植模型对比分析

李晓娟,李兴杰,冯 帆,孙慧伟,柴燕涛,高 蓉,李 润,李瑞生*

(1.中国人民解放军总医院第五医学中心,临床研究管理中心,北京 100039； 2.中国人民解放军总医院第五医学中心,临床检验诊疗中心,北京 100039； 3.解放军医学院,北京 100853)

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一[1],肝癌在全球的死亡率仅次于肺癌和胃癌,位居第三[2-3]。 由于肝癌的危害性逐步上升,全球对肝癌的预防与治疗投入了大量的基础性研究,旨在能够为肝癌的临床治疗提供基础依据,其中建立肝癌动物模型是肝癌临床与基础研究工作中必不可少的工具[4]。 由于实验动物的选择有多种,而小鼠作为又经济又易操作的实验动物,常常作为肝癌模型的首选实验动物。 BALB/c 卷毛小鼠是本实验室发现的自发突变小鼠,本实验室对其种子资源进行了纯化并展开一系列研究。 前期研究结果提示突变基因对小鼠的免疫器官、血液免疫成分和部分免疫分子均产生了一定的影响[5-6],因此本实验对BALB/c 突变卷毛小鼠与正常BALB/c 小鼠进行肝癌细胞系皮下移植模型和原位肿块移植模型构建的比较分析,以期了解突变小鼠与正常小鼠构建模型是否存在差异,同时探讨是否由于免疫方面的缺陷而使突变小鼠在肿瘤模型构建中更具有优势,为今后将该卷毛突变小鼠可能成为更有优势的肝癌动物模型提供坚实的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6 周龄SPF 级KM 小鼠2 只,雌性,18～20 g；5～6 周龄SPF 级BALB/c 小鼠20 只,雌性,16 ～18 g,均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[SCXK(京)2016-0002]。 20 只SPF 级5 ～6 周龄卷毛小鼠:20 只,16～18 g,雌性,来源于本实验室近交培育(全同胞兄妹交配)。 动物饲养在解放军总医院第五医学中心[SYXK(军)2017-0016]。 饲养环境:温度22℃～25℃,湿度40%,自由进食和饮水。 本实验通过了解放军总医院第五医学中心动物伦理委员会审查(IACUC-2017-006)。 在实验过程中,严格按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

H22肝癌细胞株为本实验室保存。 DMEM 培养基、胎牛血清均购买自美国Hyclone 公司；吸入麻醉剂异氟烷(Isoflurane)购买自深圳瑞沃德公司产品。相差倒置显微镜(Olympus,日本)；离心机(Kubota 4200,日本)；游标卡尺(上海台海工量具有限公司)；手术器械和材料由本实验室提供。

1.3 实验方法

1.3.1 皮下肿瘤移植模型建立

将H22肝癌细胞株复苏后腹腔接种于KM 小鼠体内,7 d 后小鼠腹腔形成含有H22的腹水,无菌抽取腹水于试管中,用生理盐水洗涤2 次,离心(1000 r/min)5 min,弃上清液,台盼蓝染色计数,用生理盐水调整癌细胞数至1×107/mL,制备成细胞悬液备用。 小鼠分为两组:BALB/c 小鼠组(10 只) 和BALB/c 突变卷毛小鼠组(10 只)。 将上述备用肝癌细胞悬液分别注射于两组小鼠的右侧下肢根部皮下,每只0.2 mL,连续观察7 d,注射部位出现肿瘤组织提示造模成功。

1.3.2 原位肿瘤移植模型建立

将上述备用肝癌细胞注射接种于KM 小鼠的右侧大腿根部皮下,生长一周后,解剖将肿瘤剥离,选取肿瘤组织性状和色泽较好的部分切割成肿瘤组织微块(直径0.5 ～1 mm),置于DMEM 培养基中。随后参考文献[7]进行手术,建立原位肿瘤移植模型。 术后需观察各组小鼠的活动状态,于15 d 后剖腹摘取肝肿瘤。

1.3.3 形态学观察

使用游标卡尺测量将上述两种造模方式所得肿瘤均,分别记录肿瘤的长径与短径。 按公式计算肿瘤体积(V):V=a×b2/2 (a 为长径,b 为短径)。随后分别将两组肿瘤组织置入4%甲醛固定,进行HE 染色,光镜下对病理形态学进行观察。

1.4 统计学方法

肿瘤体积的数据采用SPSS 19.0 统计学软件进行分析,实验数据均采用平均数±标准差()表示,应用配对t 检验进行组间分析比较。 P ＜0.05与P＜0.01 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠皮下肿瘤与肝原位肿瘤外观对比结果

结果显示:在相同的时间内,卷毛小鼠和正常小鼠的下肢根部均成功生长肿瘤,正常小鼠的肿瘤体积偏小,且比较扁平；而卷毛小鼠的肿瘤外观明显大于正常小鼠,且肿瘤大小较均匀,肿瘤更加立体,多呈三维状态(见图1A)。 而在相同的时间内,卷毛小鼠和正常小鼠的肝原位肿瘤也均移植成功。 卷毛小鼠的肝原位肿瘤均显著大于正常小鼠,且可观察到肿瘤与周边的正常肝组织浸润关系更密切(见图1B)。

2.2 两组小鼠皮下肿瘤与肝原位肿瘤体积对比结果

图1 两组小鼠皮下肿瘤与肝原位肿瘤外观对比结果Note.A, Subcutaneous tumor.B, Liver tumor in situ.Figure 1 Comparison of appearance of subcutaneous tumors and liver tumors in situ in two groups of mice

结果显示:正常小鼠和卷毛小鼠的皮下肿瘤体积分别平均为(55.38±30.98) mm3和(375.78±64.89) mm3,卷毛小鼠的皮下肿瘤体积与正常小鼠相比,具有显著统计学差异(P＜0.01)；正常小鼠与卷毛小鼠的肝原位肿瘤的体积分别为(3.93±1.99)mm3和(11.91±7.34) mm3,卷毛小鼠的肝原位肿瘤体积也显著大于正常小鼠(P＜0.05)(见表1)。

2.3 两种方式移植肿瘤病理形态学比较分析

病理形态学结果可见:正常小鼠肝细胞索结构完整,肝小叶结构清晰,肝细胞胞浆均匀,无坏死和炎性浸润(见图2A)。 移植皮下肿瘤后可见:正常小鼠皮下肿瘤组织的巢状结构有明显的界线,包裹肌肉的面积较少,浸润性较轻(见图2B)。 卷毛小鼠皮下肿瘤与肌肉组织之间没有清晰的界线,完全融合在一起,侵蚀性较强(见图2C)。 移植原位肿瘤后可见:正常小鼠的原位肿瘤体积较小,与正常肝组织的交界部位清晰可见,侵入性较弱；而卷毛小鼠原位肿瘤的视野内肿瘤组织几乎侵蚀了整个肝组织,完全破坏了正常的肝小叶组织,且肿瘤灶内可见瘤细胞深染,排列拥挤杂乱(见图2D、图2E)。

表1 两组小鼠两种移植肿瘤体积比较( ,n=10)Table 1 Comparison of the volume of two kinds of transplanted tumors between two groups of mice

表1 两组小鼠两种移植肿瘤体积比较( ,n=10)Table 1 Comparison of the volume of two kinds of transplanted tumors between two groups of mice

注:动物数为10 只/组,与正常小鼠比较:*P＜0.01,ΔP＜0.05。Note.10 mice each group.Compared with normal mice.* P ＜0.01,ΔP＜0.05.

肿瘤体积(mm3)Tumor volume组别Groups 皮下肿瘤Subcutaneous tumor原位肿瘤Orthotopic tumor卷毛小鼠Curly mice 375.78±64.89* 11.91±7.34Δ正常小鼠Normal mice 55.38±30.98 3.93±1.99

图2 两种移植方式肿瘤病理学检查(HE 染色)Note.A,normal liver.B-C,subcutaneous tumor of normal mice and curly mice,respectively.D-E,liver situ tumor of normal mice and curly mice,respectively.The red arrow shows junction between subcutaneous tumors and muscle tissue.The blue arrow shows junction between in situ tumors and normal liver tissue.Figure 2 Tumor pathological examination in two transplantation modes(HE staining)

3 讨论

原发性肝癌是世界范围内常见和多发的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均居高不下[8]。 迄今为止,临床上仍然缺乏行之有效的治疗手段,肝癌的治疗形势依然很严峻。 因此研究者借助于建立良好的肝癌动物模型用于肝癌发病机制以及药物治疗的研究[9]。 文献报道常见的建模方式为采用小鼠肝癌细胞系直接移植于小鼠皮下或直接将细胞悬液原位注射于肝[10-12],还有各种原位移植的改良报道[13-14]。 上述两种建模方式应用广泛,但各有优缺点,适合应用于不同的研究领域。 而对于应用突变小鼠建立肝癌动物模型,国内尚未见报道。

因此,本实验在前期研究发现卷毛小鼠具有部分免疫缺陷的基础上,应用突变卷毛小鼠与正常小鼠同时构建皮下移植肿瘤模型和原位肝移植模型并进行了比较,结果显示:卷毛小鼠与正常小鼠均造模成功,说明该突变卷毛小鼠具有作为肿瘤移植模型的潜力,而且本实验应用了肿瘤微组织块移植肝原位肿瘤,能够更好的模拟肿瘤生长的微环境,为以后的研究提供高质量的肝癌动物模型。 研究表明卷毛小鼠的皮下移植和原位移植肿瘤不仅体积均显著大于正常小鼠(P＜0.05),而且肿瘤大小较均匀,肿瘤更加立体,多呈三维状态,较正常小鼠肿瘤扁平状要更加适用于研究。 同时卷毛小鼠肝原位肿瘤与周边的正常肝组织浸润关系更密切。 病理结果能够印证这一点:卷毛小鼠皮下肿瘤与肌肉组织之间没有清晰的界线,完全融合在一起,侵蚀性较强；卷毛小鼠肝原位肿瘤的视野内肿瘤组织几乎侵蚀了整个肝组织,肝小叶组织已经完全破坏。众所周知,皮下移植肿瘤属于异位移植,多用于抗肿瘤药物药效学的初步研究,而肝癌的原位移植相较于异位移植能够更好地模拟肝癌细胞在组织中与细胞以及组织间隙相互作用的状况,同时肝癌细胞在组织中的血供与生长环境也更加接近于人体内发生发展的过程,因此能够更好地反映出肝癌发病机制分子生物学研究的特性[15]。 而本实验众多结果均显示卷毛小鼠的肝癌成模均优于正常小鼠。下一步我们将对肝癌肿瘤形成机制及抗肿瘤药效学对模型进行评价研究。

综上所述,BALB/c 突变卷毛小鼠在形成肝癌皮下移植肿瘤和肝脏原位移植肿瘤的能力显著优于正常BALB/c 小鼠,我们有理由推断由于突变基因引起的部分免疫缺陷使该突变小鼠更易于成模,未来预期可将该突变卷毛小鼠应用于肝癌动物模型的各项研究中,本实验为我们进一步利用肝癌动物模型开展各项研究提供了很好的实验平台,也将该突变卷毛小鼠应用于新的研究领域提供坚实的理论支持。