猪作为人类疾病模型的研究进展

陈雨荣,安星兰,汪正铸,张 胜,翟岩辉,代相鹏*,李子义*

(1.吉林大学第一医院人类疾病动物模型国家地方联合工程实验室, 长春 130021；2.吉林大学动物医学学院, 长春 130062)

动物模型指非人类的活体实验动物,用于疾病、基因功能、药学及其他科学问题的研究[1]。 “动物模型”这一术语在文献中首次出现于上世纪60年代,到目前为止,已有数以千计有价值的动物模型被应用于医学研究的各个领域[2]。 啮齿类动物是目前数量最大、应用最广泛的动物模型。 然而啮齿类动物与人亲缘关系较远,其遗传、体型以及寿命与人类有较大差异[3]。 啮齿类动物模型存在的缺陷限制了研究人员对人类疾病、药物开发以及疾病治疗方案的研究。 非人灵长类动物与人类亲缘关系近,是最好的人类疾病动物模型,但存在实验费用昂贵、实验技术复杂、动物资源匮乏和伦理等问题[4]。 大量研究表明,猪与人的氨基酸同源性达84.1%, 在解剖结构、生理代谢以及疾病发生机理上与人有很多相似之处[5]。 猪作为人类疾病研究的动物模型优势众多,其应用可追溯到上世纪九十年代末[6]。 以猪作为人类疾病动物模型的研究涉及糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病、遗传性疾病、肿瘤以及其他领域,这些模型对于揭示疾病发生的机制、寻找药物靶点、开展药物筛查和药效评价、找到治疗及诊断疾病的方法等具有重要意义。由于猪的品种、获得模型的方法以及检测指标差异,造成很多模型在表面效度、结构效度、预测效度方面存在差异,从而影响了猪在人类疾病研究中的应用。 为深入理解不同疾病的猪模型、不同方法建立的猪模型在模拟人类疾病中存在的问题,为更好的利用猪作为人类疾病模型研究人类疾病的发生发展和探索药物治疗策略,本文将重点综述近年来获得的猪模型在人类疾病研究中的应用现状和存在的问题,为优化猪模型的建立和应用提供理论参考。

1 人类疾病模型猪的研究进展

1.1 糖尿病

我国成人糖尿病患者数量达1.14 亿,高居世界第一[7]。 糖尿病会引起心血管和脑血管疾病、视网膜病变、肾病、周围神经病变以及下肢动脉病变等多种并发症[8]。 研究表明,猪在进食方式、胰腺形态及发育水平、胃肠道结构、代谢水平以及血糖水平方面与人类非常相似,且糖尿病模型猪在疾病发展方面更接近人[9-10]。 Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)的特征是胰岛素依赖性,主要是由于胰岛β 细胞功能遭到破坏引起胰岛素的极度缺乏[11]。 通过胰腺切除术获得的Ⅰ型糖尿病猪模型的发病率和死亡率较高且影响了胰腺的外分泌功能,而通过静脉注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ,150 mg/kg)诱导的糖尿病动物存活时间长,更适合用于长期的糖尿病研究[12]。 Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)占糖尿病总人数的90%以上,其特征是胰岛素抵抗性[13]。 1979 年,Phillips等[14]人培育成自发性Ⅱ型糖尿病猪“Low K”品系,该品系猪的葡萄糖清除率明显降低,F-5 代的葡萄糖耐量降低的遗传率约为0.26,但“Low K”品系葡萄糖耐量降低的特性最终未能维持下来。 Xi 等[15]利用高脂高糖饲料对中国贵州小型猪进行6 个月的诱导饲养后,该猪出现胰岛素抵抗、轻度糖尿病和动脉粥样硬化病变。 该模型猪可能是研究糖尿病性血脂异常并发动脉粥样硬化的良好动物模型。吴延军等[16]采用高脂高糖饲料联合低剂量STZ 方法成功建立广西巴马小型猪T2DM 模型,该模型猪特征明显且更为稳定,均出现胰岛素抵抗和葡萄糖耐量受损等症状。 Renner 等[17]培育出在胰岛中表达显性抑制肠促胰岛素( glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor, GIP ) 受体(GIPRdn)的转基因猪,该猪葡萄糖耐量受损,胰岛素分泌减少,β 细胞数量减少但凋亡不明显。GIPRdn转基因猪可用于研究GIP 在葡萄糖稳态和胰腺发育中的作用。 Umeyama 等[18]培育出人肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)突变体猪,22 头转基因仔猪中18 头在断奶前死亡,其余仔猪胰岛发育不全,非空腹时血糖高于正常水平,该模型可用于研究青少年发病的成人型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young,MODY)。 胰岛素(insulin,INS)基因的突变会引起永久性新生儿糖尿 病 ( permanent neonatal diabetes mellitus,PNDM)[19]。 Renner 等[20]培育出在猪胰岛β 细胞中特异性表达INSC94Y的突变体猪,该猪的胰岛素蛋白错误折叠,糖尿病表型稳定且其症状可通过胰岛素治疗改善,是胰岛素补充和胰岛移植的良好实验模型(见表1)。

1.2 心血管疾病

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病发病的主要病理基础,严重威胁人类健康[21]。Prescott 等[22]发现了第一个出现自发性高胆固醇症和动脉粥样硬化病变的猪品种。 该猪的载脂蛋白B和载脂蛋白U 的Lpb5 和Lpu1 等位基因发生突变,猪的动脉出现脂质条纹以及钙化、坏死的斑块,这些病变特征与人类晚期动脉粥样硬化病变非常相似。 刘录山等[23]采用高脂高胆固醇饲料(基础饲料+2%胆固醇和10%猪油)喂养贵州小香猪12 个月后发现其血脂水平明显升高, 并出现AS 病变斑块,病理形态学结果表明这些斑块具有人类成熟斑块的特点且病变分布特点也与人类AS 病变一致。 冯大明等[24]选用贵州小香猪,采用颈总动脉球囊损伤方法联合高脂饲料喂养方式建立了AS 小型猪模型,模型猪血管内膜增厚并出现病理性血管重构。此外,Whyte 等[25]人建立了过表达人过氧化氢酶(human catalase,hCat)转基因猪。 转基因仔猪hCat mRNA 表达和hCat 蛋白表达量均升高。 内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)可释放一氧化氮(NO),进而调节血管功能及结构。 Hao 等[26]通过核移植建立了胎盘血管内皮细胞过表达eNOS 的转基因猪,研究人员预测该模型猪成年后会出现血管损伤表型(见表2)。

表1 糖尿病模型猪Table 1 Pig models of diabetes

1.3 遗传性疾病

囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)是第7 对染色体上CF 基因突变引起的常染色体隐性遗传病。 CF小鼠模型无法表现与人类相似的肝、肺、呼吸道及肠道病变[27]。 2008 年,Rogers 等[28]采用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的同源重组技术获得了CFTR 双等位基因敲除猪。 新生CFTR-/-猪的临床、电生理和病理结果与CF 新生儿相似,出现胎粪性肠梗阻、胰腺外分泌功能不全等症状。2013 年,Stoltz 等[29]建立肠内表达CFTR 的CF 猪模型。 CFTR 基因表达可诱导新生仔猪回肠负离子转运,挽救胎粪肠梗阻表型,但无法改善胰腺外分泌功能。 血友病A 是一种X 染色体上的凝血因子Ⅷ异常导致的遗传性疾病。 2012 年,Kashiwakura等[30]建立了敲除F8 基因的血友病A 猪模型。 模型猪具有与人类血友病A 类似的严重出血倾向,且注射人F8 凝血因子可起到治疗效果。 家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)是一种罕见的常染色体显性遗传病,患者低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平增高并常伴有早发型冠心病。 Carlson 等[31]利用TALEN 技术构建了LDL 受体(LDL receptor,LDLR)基因敲除小型猪,该模型猪是研究FH 的理想实验动物模型。 家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)是一种常染色体显性遗传性疾病,患者整个结直肠布满大小不一的腺瘤。 Flisikowska 等[32]通过将突变的腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)定点插入到猪基因组获得FAP 猪,具有与人类相似的发病进程和息肉生长位置。 血管性血友病(von Willebrand disease,vWD)是血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)基因突变引起的遗传性出血性疾病。 利用CRISPR/Cas9 技术敲除猪vWF 双等位基因,可以获得vWD 猪模型[33],该猪出血时间明显延长,表现出严重凝血障碍且血浆中无vWF 抗原。 酪氨酸血症Ⅰ型(hereditary tyrosinemia type I,HT1)是由于延胡索二酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH)基因突变而导致FAH 缺乏,酪氨酸及其代谢产物蓄积,造成肝损害的伴常染色体隐性遗传病。 通过敲除猪FAH 基因而建立的人遗传性HT1 猪模型,仔猪出现严重肝损伤和与急性肝衰竭等症状。 FAH 基因敲除猪可用于HT1 和自发性急性肝衰竭的研究以及肝细胞治疗效果的临床前测试[34]。 酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)与人类皮肤白化病的发生相关。 TYR 双等位基因突变猪的仔猪皮肤、毛发和眼睛中的黑色素完全消失,该模型猪是研究人类白化病发病机制及治疗的重要模型[35](见表3)。

表2 心血管疾病模型猪Table 2 Pig models of cardiovascular disease

表3 遗传性疾病模型猪Table 3 Pig models of hereditary disease

1.4 神经退行性疾病

神经退行性疾病是一类进行性发展的致残,严重可致死的疾病,其主要特征为特异性神经元的大量丢失。 常见的神经退行性疾病包括亨廷顿舞蹈症(huntington’ s disease, HD)、 阿 尔 茨 海 默 病(alzheimer disease,AD)、帕金森综合征(parkinson’s disease,PD) 和肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等。 HD 是由位于第四号染色体上的亨廷顿基因(huntingtin,HTT)发生突变所导致的常染色体显性遗传病。 2001 年建立的htt75Q突变猪并没有出现HD 表型[36]。 httN208-105Q突变猪脑内的变异蛋白虽然可诱导神经元凋亡,但转基因猪吮吸困难,存活时间较短[37]。 2018 年,李晓江、李世华和赖良学团队[38]首次利用CRISPR/Cas9 技术成功建立HTT 基因敲入猪模型,模型猪表现出如体重下降、行为异常以及多棘神经元严重退行性病变等HD 症状。 脑内β 淀粉蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉积是诱发AD 的原因,Aβ 蛋白是由淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)水解产生,目前已明确早老素1 基因(presenilin 1,PSEN1)、早老素2 基因(presenilin 2, PSEN2)、APP基因和载脂蛋白E 基因(apolipoprotein E,ApoE)为AD 四大致病基因[39]。 2009 年,Kragh 等[40]建立了APP695sw转基因AD 猪模型,但1 岁的AD 转基因猪没 有 表 现 出 记 忆 障 碍[41]。 携 带 APP695sw和PSEN1M146I双基因的转基因AD 猪在10-18 月龄的猪脑神经元中会出现Aβ-42 的蓄积[42]。 2017 年,Lee 等[43]利用多顺反子系统建立了携带hAPP、hTau 和hPSEN1 三个突变基因的AD 转基因猪,该转基因猪大脑中出现Aβ-40 和Aβ-42 的蓄积。 PD是神经系统退化性疾病,黑质多巴胺神经元变性死亡是主要诱因,部分患者出现parkin 基因、帕金森蛋白7 基因(DJ-1)和磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶(PTEN-induced putative kinase,PINK)的突变。 但用CRISPR/Cas9 系统建立的parkin、DJ-1和PINK 三基因敲除猪并未出现PD 症状[44]。 同样,PINK1 和PINK2 双基因敲除猪直至7 月龄时仍未表现出PD 症状[38]。 Nielsen 等[45]采用肌注1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyL-4-phenyL-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)11 周的方法获得了具有PD 症状的猪,动物出现运动迟缓、僵硬、协调和咀嚼困难等症状。 ALS 为脊髓前角及脑干运动神经元及锥体束进行性变性引起的病征。研究表明,超氧化歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、反式激活应答DNA 结合蛋白(transactive response DNA binding protein,TARTDP)、融合肉瘤蛋白基因(fused in sarcoma,FUS)、血管生成素(angiogenin,ANG)和自噬受体蛋白基因(optineurin,OPTN)这5 种基因突变后可引起典型的ALS 疾病表型[46]。 实验表明,hSOD1G93A转基因猪表现有运动神经受损、骨骼肌变性等ALS 的典型症状[47]。TDP-43M337V突变的转基因猪出现皮肤松弛、运动障碍和过早死亡等症状,检测发现了PSF 相关的、频繁出现在的ALS 患者脑神经元中的异常RNA 剪接[48](见表4)。

1.5 肿瘤模型

模型猪也被用于研究不同类型的肿瘤的发生机制。 密苏里大学[49]通过选育获得的Sinclair 小型猪具有较高的皮肤黑色素瘤发病率,且其黑色素瘤与人类黑色素瘤在遗传上有一定的相似性。Sinclair 猪和德国慕尼黑大学[50]选育的MMSTROLL 猪以及由Libechov 研究所[51]选育的MeLiM猪是常用的自发黑色素瘤模型。 研究人员发现黑色素瘤与猪单细胞抗原复合体(swine leukocyte antigen, SLA)、 黑 素 皮 质 素 1 型 受 体 基 因(melanocortin 1 receptor,MC1R)和小眼畸形相关转录因子(microphtalmia-associated transcription factor,MITF)基因等相关[52]。 2011 年,Luo 等[53]利用重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的同源重组基因打靶技术获得BRCA1基因敲除的杂合子(BRCA1+∕-)乳腺癌Yucatan 小型猪,但均在出生后18 d 内死亡。 2015 年,Donninger等[54]分离猪乳腺上皮细胞,用SV40LT(simian virus 40 large t antigen)载体转染获得永生化的猪乳腺癌细胞,利用RNA 干扰技术使BRCA1 基因失活(BRCA1+∕-)建立了第一个猪乳腺癌细胞系,该细胞系具有乳腺癌干细胞的特征。 2012 年,Leuchs等[55]培育了Tp53R167H(tumor protein 53)基因突变猪,但仔猪表型正常。 随后,2014 年,Sieren 等[56]也建立了Tp53 基因突变猪,性成熟的纯合子猪发生了淋巴瘤、成骨肿瘤和肾肿瘤病变。 敲除Tp53 的猪可以作为自发性骨肉瘤猪模型,其长骨和颅骨发生多个骨肉瘤[57]。 鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)突变对于胰腺癌、非小细胞肺炎以及大肠癌的发生至关重要[58-59]。2015 年,Li 等[60]建立的KRAS 基因突变猪的新生仔猪未发生肿瘤。 Schook 等[61]建立的KRasG12D和TP53R167H诱导表达的转基因猪“oncopig”可发生间质瘤。 Callesen 等[62]通 过 激 活 KRAS 和 cMyc(cellular myelocytomatosis oncogene),失活p53 和成视网膜细胞瘤蛋白基因(retinoblastoma protein,pRB),建立了诱导性“oncopig”肠癌模型,经诱导处理后,三分之一的猪表现为十二指肠神经内分泌癌,并伴有淋巴结转移。 通过在不同部位诱导这些基因表达,可以获得“oncopig”软组织瘤猪模型[63]以及“oncopig”胰腺导管腺癌猪模型[64](见表5)。

表4 神经退行性疾病模型猪Table 4 Pig models of neurodegenerative disease

1.6 其它疾病模型

免疫缺陷动物可用于肿瘤标本异种移植以及建立免疫系统人源化动物模型,为研究癌症的发病机制和肿瘤药物的安全性与有效性奠定基础。SCID(severe combined immunodeficient,SCID)猪可由自然突变或通过基因编辑而得到,涉及Artemis 基因、白介素受体γ 链基因(interleukiN-2 receptor gamma gene,IL2RG)和重组活化基因RAG1/2 基因(recombination activating gene 1/2)[65]。 2012 年发现的Artemis 基因自然突变猪的外周血中缺乏B、T细胞而NK 细胞正常,胸腺和淋巴结明显萎缩[66],耳皮下注射的人黑色素瘤细胞和胰腺癌细胞能形成肿瘤[67]。 IL2RG 基因敲除猪的胸腺发育不全,T、NK 细胞缺乏,B 细胞数量正常但无法正常分泌抗体和发挥抗原递呈作用[68]。 采用锌指核酸酶技术(zinc-finger nucleases,ZFNs)获得的IL2RG 基因敲除公猪表现出SCID 样表型[69]。 CRISPR/Cas9 技术获得的IL2RG 基因敲除的纯合母猪全部表现SCID表型,并且缩短了实验周期[70]。 2014 年,赖良学团队[71]发现RAG1 以及RAG2 双等位基因突变的仔猪免疫器官发育不全,外周血中缺乏成熟的B 和T细胞,而RAG2 杂合突变仔猪表型正常。 进一步研究发现,RAG1 基因纯合纯合敲除猪的新生仔猪胸腺发育不全且外周血中缺乏成熟T、B 细胞[72]。 将人诱导多能干细胞注入RAG2 双等位基因敲除猪耳部及腹部,受体猪分别于12 d、7.5 周后在注射部位形成明显畸胎瘤[73]。 Suzuki 等[74]建立的RAG2 双等位基因敲猪最长存活至34 d。 而RAG2 和IL2RG双基因敲除猪的仔猪胸腺发育异常,外周血中缺乏成熟的B、T 细胞,NK 细胞减少[75]。 IL2RG 和ARTEMS 双基因敲除猪的仔猪缺乏B、T、NK 细胞[65]。 吉林大学第一医院人类疾病动物模型国家地方联合工程实验室李子义、杨永广团队联合中科院动物所周琪团队,目前已获得RAG1 和IL2RG 双基因突变的(RAG1-/-/IL2Rγ-/Y)SCID 猪,仔猪表现出明显的SCID 症状,这些免疫缺陷动物模型对免疫系统人源化猪模型的建立具有重要意义。

表5 肿瘤模型猪Table 5 Pig models of cancer

2 展望

猪的生理学、解剖学和遗传学特征与人类非常接近,是目前很多人类疾病的理想动物模型。 表面效度、结构效度、预测效度是评价动物模型的三个方面。 表面效度指模型的表征与人类疾病特征相似,利用人类疾病的发病机制建立的模型则具有结构效度,模型产生的预测在临床有效则具有预测效度[76]。 对于糖尿病猪模型,胰腺切除副作用大,表面效度不佳。 利用人工选育、化学或膳食诱导以及基因工程技术建立的猪糖尿病模型均能较好地模拟人类糖尿病的临床症状,具有表面效度,但其中绝大多数模型仍缺乏结构效度和预测效度。 转GIPRdn模型猪被用于研究利拉鲁肽治疗青少年MODY 患者的安全性及有效性的研究,具有一定的预测效应[77]。 对于AS 猪模型,猪与人的心血管系统相似度高,猪AS 模型具有较好的表面效度,尚无预测效度。 利用基因工程技术建立的疾病模型表面效度直接,一些通过对致病基因进行编辑从而建立的动物模型还具有结构效度,可以满足研究者的不同需要,但预测效度尚未体现,如敲除CFTR 基因的CF 猪模型以及敲除F8 基因的血友病A 模型等。一些基因工程模型具有结构效度但缺乏表面效度,如转htt75Q的HD 猪模型未表现出HD 表型。

目前,研究人员已经成功建立了大量的人类疾病猪模型,这些模型对于研究人类重大疾病发病机制、寻找预防和治疗办法具有重要意义。 但其中一些模型未形成稳定表型、仍无法准确模拟人类疾病以及未能广泛应用于基础理论研究等。 因此,在人类疾病猪模型的研究中,我们需要有针对性的深入研究,形成完善的技术体系,并将疾病动物模型建立和疾病发病机制基础研究和治疗等临床研究有机结合,为人类疾病的研究提供适合的动物模型。