天然免疫DNA感受器及其抗动物疫病研究进展

杨 洁，季星妤，朱媛媛，朱建中

（1.扬州大学兽医学院，扬州225009；2.扬州大学比较医学研究中心，扬州225009；3.江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心，扬州225009；4.农业与农产品安全国际联合研究实验室，扬州225009）

天然免疫（innate immunity）是宿主抵抗外界病原感染的必不可少的第一道防线，主要由生理屏障、化学屏障和免疫细胞、分子构成。当外界病原微生物或其产物即病原相关分子模式（pathogen aassociated molecular patterns，PAMPs）进入机体时，位于细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）即将其识别并活化，产生相应的免疫应答。在此过程中，干扰素（interferons，IFNs）、干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）和一些炎症因子诱导产生，抑制病原微生物复制，减轻机体组织器官的损伤[1]。

天然免疫受体（PRRs）主要包括Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）、NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）、RIG-I样受体（RIG-I-like helicase receptors，RLRs）、C型凝集素样受体（C-type lectin like receptors，CLRs）和胞浆/胞核DNA受体（Cytoplasmic/nuclear DNA receptors，CDRs）。TLRs是最早被发现和研究的模式识别受体，是定位于质膜或内体膜上的一种跨膜蛋白，主要识别细菌外膜组分和病原微生物核酸[2]。NLRs是胞质受体中数量最庞大的家族，根据其氨基端结构域的差异，可将NLRs分为NLRAs、NLRBs、NLRCs和NLRPs，NLRs在炎性小体的形成和调节信号通路等方面发挥巨大作用[3-5]。RLRs包括RIG-I、MDA5和LGP2，RIG和MDA5主要识别胞浆双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA），LGP2无信号活性，仅在MDA5和RIG-I介导的信号通路中起调节作用[6-7]。CLRs是一类定位于免疫细胞表面的跨膜蛋白，目前已知的具有免疫活性的常见CLRs包括Dectin-1、Dectin-2和Mincle，功能均与抗真菌感染有关[8-10]。2007年，Takaoka等[11]发现一种与天然免疫相关的胞质DNA受体，并将其命名为DAI，这就是最早发现的胞质DNA受体。此后，AIM2、IFI16、DDX41、DNA-PK、MRE11、DDX36、cGAS等胞质/胞核DNA受体相继被发现。由于胞质/胞核DNA受体的发现时间较晚，他的功能及调节机制尚未研究透彻，已成为近年来的研究热点。

不同DNA受体分别通过接头蛋白髓样细胞分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和干扰素刺激基因（stimulator of interferon genes，STING），产生I型干扰素和炎性因子，抵抗病原微生物入侵，减轻细胞损伤。近年来，随着畜牧养殖业的快速发展，动物疫病日益受到重视。非洲猪瘟病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒、马立克病毒等DNA病毒都对畜禽养殖业产生着极大的影响，然而其引发天然免疫的作用机制尚不明确。为了更好的解决生产实践中遇到的问题，天然免疫信号通路的研究已成为人们关注的热点。本文重点介绍几种DNA受体介导的天然免疫信号通路，并总结其在常见畜禽疫病中的研究进展。

1 Toll样受体9

1.1 信号通路 Toll样受体9（Toll-like receptor 9，TLR9）是定位于内质网的跨膜蛋白，能够识别存在于细菌或病毒DNA中的非甲基化胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（Cytosine phosphate guanine，CpG）[12]。活化的TLR9与上述配体形成马蹄状2:2复合物并易位至内体，将信号传递给下游接头蛋白MyD88。MyD88的DD结构域与IRAK-1和IRAK-4相互作用，募集TRAF6和TRAF3，并与IKKα、Opn等形成免疫复合物。随后，TRAF6下游TAK1构象改变，磷酸化IKKs和MAPKs，分别激活转录因子NF-κB和AP-1。这些转录因子易位至细胞核，诱导生成IL-6、IL-12、TNFα等炎性因子，此外，转录因子IRF5和IRF7可直接被MyD88免疫复合物磷酸化、活化并易位至细胞核转录，诱导产生I型干扰素和干扰素刺激基因（图1）[13]。

图1 TLR9信号通路[13]Fig.1 Signal pathway of TLR9

1.2 哺乳动物TLR9与抗感染免疫 大量体外研究表明，哺乳动物TLR9介导的天然免疫能有效抵御外界病原的入侵。在一些细胞系中，TLR9能激活下游NF-κB通路抑制猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）和猪Ⅱ型圆环病毒（Porcine circovirus 2，PCV2）复制[14-15]。敲低猪小肠上皮细胞系中的TLR9，减弱了该细胞对猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的抵抗力[16]。

1.3 禽类TLR21与抗感染免疫 迄今为止，未在任何家禽体内发现TLR9。有研究发现家禽TLR21与哺乳动物TLR9发挥相似功能[17]。肠炎沙门氏菌基因组DNA能激活鸡巨噬细胞TLR21，诱导抗感染免疫[18]。过表达和敲低鸭成纤维细胞系TLR21能分别抑制和促进鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）的复制[19]。雏鹅新型病毒性肠炎病毒（New gosling type viral enteritis virus，NGVEV）感染鹅外周血单个核细胞能激活TLR21-NF-κB通路，诱导产生炎性因子[20]。

1.4 TLR9/TLR21与免疫佐剂CpG 人工合成的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG oligodeoxyucleotides，CpGODN）能有效激活TLR9/TLR21触发天然免疫，可作为免疫增强剂预防畜禽传染病。口服CpG-ODN能加强仔猪肠道黏膜免疫，有效提高仔猪对猪传染性胃肠炎病毒（TEGV）、产肠毒性大肠杆菌和猪巴氏杆菌活疫苗的免疫应答[21-23]。用CpG-ODN预处理新生牛，可减少牛疱疹病毒I型（Bovine herpesvirus 1，BoHV-1）的感染机率，然而这种保护效果十分短暂，仅能持续几天[24]。在山羊乳腺炎的预防中，注射CpG-ODN可提高山羊对大肠杆菌型乳腺炎的抵抗力[25]。CpG-ODN能增强雏鸡对禽流感病毒、马立克病毒、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和空肠弯曲杆菌的抵抗力[26-30]。种母鸡注射CpG-ODN能降低雏鸡的J型禽白血病毒感染率[31]。CpG-ODN预处理18日龄鸡胚，雏鸡存活率提高且传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）的感染率下降[32]。CpG-ODN还能作为免疫佐剂加强禽网状内皮组织增生症病毒亚单位疫苗、马立克病毒苗和鸭重组细小病毒苗的保护力[33-35]。

2 DNA依赖的干扰素调节因子激活物

2.1 信号通路 DNA依赖的干扰素调节因子激活物（DNA-dependent activator of interferon-regulatory factors，DAI）是位于胞浆中的双链DNA（doubulestranded DNA，dsDNA）识别受体，由Zα、Zβ、D3和信号转导结构域组成[11]。DAI通过D3结构域识别dsDNA，Zα、Zβ结构域使其形成更紧密的DAIDNA复合物，DAI多聚化，沿着DNA骨架串联排列，招募TBK1和IRF3，诱导产生I型干扰素。转录因子IRF7也部分参与此通路，但仅诱导IFNα-4的产生[11,36]。DAI能够通过D3结构域直接与RIPK1结合，磷酸化NF-κB，该过程受RIPK3正向调控（图2）[37]。

图2 DAI信号通路[37]Fig.2 Signal pathway of DAI

2.2 DAI与抗感染免疫 DAI在抗病毒天然免疫中发挥关键作用，参与病毒识别，调节细胞凋亡，激活炎症小体等一系列反应。目前DAI介导的抗感染免疫研究主要局限于人和小鼠，对于其在常见家养动物中的研究报道较少，仅有研究报道DAI参与猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）的抗感染免疫[38]。

3 DEAD盒多肽41

3.1 信号通路DEAD盒多肽4 1（DEAD box polypeptide 41，DDX41）是胞质DExD/H-box解旋酶家族蛋白，由1个DEAD结构域和1个解旋酶结构域组成[39]。病原感染宿主细胞后，将dsDNA或第二信使释放到细胞质，随后酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）磷酸化DDX41上Y414位点激活DDX41，活化的DDX41可通过DEAD结构域直接与双链DNA和STING结合，STING活化与TBK1形成复合物，随后IRF3被磷酸化激活，诱导I型IFN的表达（图3）[40]。

图3 DDX41信号通路[40]Fig.3 Signal pathway of DDX41

3.2 DDX41与抗感染免疫 有研究报道，猪DDX41在猪肾细胞系中参与dsDNA和PRV介导的I型干扰素信号通路[41]。鸡DDX41也能在鸡成纤维细胞系中激活DDX41-STING-TBK1-IRF3通路[42]。过表达鸭成纤维细胞DDX41能增强β干扰素活性（interferon β，IFN-β），并显著抑制鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）的复制；反之则由dsDNA和DEV刺激诱导的IFN-β产量下降[43]。

4 PYHIN蛋白家族

PYHIN胞质蛋白家族成员具有共同类似的氨基端PYD结构域和羧基端HIN-200结构域。此家族受体的PYD结构域能与其他介质的PYD结构域产生同源作用，将信号传递给下游蛋白，介导一系列抗感染反应。PYHIN蛋白家族成员主要包括AIM2、IFI16、IFIX、IFI202、IFI203、MNDA等，各物种的PYHIN蛋白种类各不相同。目前已知人有4种PYHIN蛋白（AIM2、IFI6、IFIX、MNDA），小鼠13种（IFI202、AIM2、MNDAL、IFI203等），马2种（AIM2、IFI16），牛羊1种（IFI16-L），猪1种（IFI16）[44]。本文将介绍AIM2和IFI16 2种PYHIN蛋白。

4.1 黑色素瘤缺乏因子2

4.1.1信号通路 黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）主要非特异性地识别胞质中长度不小于80 bp的dsDNA[45]。病原微生物侵入胞浆时，病原dsDNA的糖-磷酸骨架通过静电吸引与带负电的HIN-200结构域结合，PYD结构域与下游接头蛋白ASC的PYD结构域同源结合，随之ASC羧基端CARD区与caspase-1前体的CARD区结合，形成一个类炎性小体的大分子复合物[45]。活化的caspase-1切割白介素IL-1β和IL-18前体，形成成熟的IL-1β和IL-18；同时，caspase-1也切割底物gasdermin D，诱导细胞凋亡，并促使成熟IL-1β、IL-18从细胞中释放（图4）[46]。

图4 AIM2、IFI16信号通路[46]Fig.4 Signal pathway of AIM2 and IFI16

4.1.2 AIM2与抗感染免疫 目前已有大量研究表明AIM2在人和小鼠的抗感染免疫中发挥重要作用。AIM2可对病原菌弗朗西斯菌种活疫苗株、弗朗西斯菌、单核细胞增生李斯特菌、肺炎链球菌、分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、流产布鲁氏菌、衣原体、巨细胞病毒、痘苗病毒等产生免疫应答。此外，AIM2还能介导宿主防御真菌（烟曲霉）和原生动物（伯氏疟原虫）的侵袭[47]。然而，AIM2是否存在于其他物种却仍待考证。迄今为止，科学家仅发现马具有完整的AIM2基因，而在猪、牛、绵羊、狗、大象、美洲驼、海豚等动物中均未发现完整的AIM2基因，仅有证据显示上述物种（除猪以外）可能存在AIM2假基因[44]。尽管某些物种中可能缺失AIM2，但同时也表明他们已经进化出了抵御DNA病毒和细胞内细菌的替代机制。

4.2 γ干扰素诱导蛋白16

4.2.1 信号通路 γ干扰素诱导蛋白16（γ-interferoninducible protein 16，IFI16）主要定位于细胞核，少量存在于细胞质，由2个HIN结构域（HIN-A、HIN-B）和1个PYD结构域组成[48]。IFI16主要识别dsDNA，某些情况下也可识别单链DNA（singlestranded DNA，ssDNA）和十字型DNA[45,49]。IFI16主要通过激活炎性小体和诱导干扰素2条通路抵御病原微生物。与AIM2介导的炎性小体通路类似，IFI16也可通过与ASC的相互作用激活caspase-1依赖性炎性小体通路（图4）[13,50]。IFI16识别病原DNA后直接与STING结合，招募下游TBK1和IRF3，诱导产生干扰素（图4）[46,51]。IFI16还能直接与病毒启动子结合抑制病毒复制，以疱疹病毒为例，在抗人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）早期感染时，IFI16协同Sp1转录因子与病毒UL54启动子结合，直接抑制病毒复制[52]。

4.2.2 IFI16与抗感染免疫 诸多研究证明了IFI16在抗人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染中的重要作用[53]。IFI16在畜禽抗感染研究也取得了一些进展。IFI16通过介导炎性小体抵御牛I型疱疹病毒感染[54]。dsDNA转染犬角质形成细胞时，IFI16表达量升高，诱导产生炎性小体，然而犬乳头瘤病毒（Cannie papilloma virus 2，CPV-2）感染该细胞并不能检测到IFI16表达升高，这可能与该病毒的逃逸机制有关[55]。

5 环鸟苷-腺苷酸合成酶

5.1 信号通路 环鸟苷-腺苷合成酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS）是近年来发现的作用机制明确的新型胞质DNA感受器，广泛存在于哺乳动物的各种细胞中。cGAS由1个核苷酸转移酶结构域和2个DNA结合结构域组成[56]。cGAS可识别大于16 bp的dsDNA，此该识别过程不具有序列依赖性[56-57]。有研究报道cGAS还可识别ssDNA和dsRNA，然而dsRNA并不能活化cGAS[58]。cGAS与dsDNA形成一个2∶2的“梯状”复合体，cGAS构象变化，催化ATP和GTP形成第二信使cGAMP，cGAMP作为第二信使能与内质网上的STING二聚体结合，STING构象改变进入活化状态，活化的STING能与TRIM32和TRIM56结合合成泛素链，激活IKKα/β，招募TBK1和IKKε，随后转录因子IRF3/7和NF-κB发生磷酸化，核转位诱导合成干扰素和其他细胞因子，参与免疫应答（图5）[57,59]。

图5 cGAS信号通路[57,59]Fig.5 Signal pathway of cGAS

5.2 cGAS与抗感染免疫 目前已有诸多研究围绕cGAS的抗感染作用展开，cGAS-STING通路在抗细菌病毒感染中的作用已得到广泛认可。弗朗西斯菌、结核分支杆菌、志贺菌、B族链球菌等均能激活cGAS-STING-IRF3通路，诱导产生干扰素[58]。已报道cGAS识别的DNA病毒主要包括I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus l，HSV-1）、人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）、腺病毒（Adenovirus，AdV）、牛痘病毒（Vaccinia virus，VACV）和杆状病毒等[60]。某些逆转录病毒如HIV、鼠白血病病毒可在反转录酶的作用下合成dsDNA，被cGAS识别[61]。cGAS的抗感染研究已不再局限于人和小鼠，其在抗畜禽传染病中的作用也受到了广泛的关注。有研究报道猪cGAS参与PRV诱导的IFN-β活化，并且cGAS下游的第二信使cGAMP水解酶-核苷酸外焦磷酸酶磷酸二酯酶1（Nucleotide exo pyrophosphatase phosphodiesterase 1，ENPP1）能促进PRV复制[62]。PCV-2作为一种单链DNA病毒也可以激活cGAS-STING通路[63]。非洲猪瘟（African swine fever，ASF）作为去年来在我国猪群暴发的烈性传染病，已成为全国实验室的研究热点。非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）China 2018/1毒株和SY18毒株的DP96R蛋白的羧基端保守序列均可以通过抑制TBK1磷酸化，阻断cGASSTING介导的IFN-β和NF-κB启动子活性，实现免疫逃避[64-65]。ASFV Armenia/07毒株通过cGAMP依赖性机制阻断STING和TBK1磷酸化，抑制cGAS介导的IFN-β启动子活性[66]。ASFV Georgia/2007毒株的MGF360蛋白和MGF505蛋白能抑制cGAS/STING介导的IFN-β和NF-κB启动子活性[65]。马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）能引发鸡T细胞淋巴瘤，在经济上具有重要意义，并有助于了解疱疹病毒相关的致癌性。MDV特异性蛋白RLORF4能阻断cGAS和STING诱导的IFN-β和NF-κB启动子活化，阐明了RLORF4直接参与MDV减毒的机制[67]。MDV编码的VP23蛋白也能够通过IRF7特异性阻断鸡成纤维细胞和巨噬细胞中cGAS和STING诱导的IFN-β活化[68]。

6 胞核DNA感受器

DNA依赖蛋白激酶（DNA-dependent protein kiase，DNA-PK）是由DNA-PKcs，Ku70和Ku80亚基组成的异源三聚体蛋白复合物，主要参与修复DNA损伤[69]。2011年，有研究发现Ku70蛋白能识别胞质中大于500 bp的dsDNA，激活IRF1和IRF7诱导产生Ⅲ型干扰素[70]。随后DNA-PK复合物被鉴定为成纤维细胞中特有的DNA传感器，能通过STINGTBK1-IRF3诱导产生I型干扰素[71]。核DNA损伤传感器MRE11和Rad50也被证实参与胞质dsDNA的识别，MRE11依赖STING诱导产生I型干扰素，Rad50则通过CARD9/Bcl10复合物激活NF-κB[72-73]。2019年，Wang等[74]发现了一种胞核DNA感受器——hnRNPA2B1，它能与进入细胞核的病毒DNA结合后二聚化，在JMJD6酶的作用下去甲基化，由细胞核易位至细胞质，激活TBK1/IRF3诱导产生I型干扰素。胞核DNA感受器识别dsDNA的结构基础，调节机制以及如何避免识别自身DNA等尚未研究透彻，其在畜禽疫病研究方面也处于空白状态，有待后续研究补充。

7 总结与展望

2000年，TLR9作为天然免疫DNA传感器的作用首次被发现，随后DAI、AIM2、IFI16、cGAS、DDX41、DDX36、DHX9、DNA-PK等胞浆/胞核DNA感受器也陆续被发现。随着病原DNA诱导的天然免疫应答逐渐受到人们的关注，这些DNA受体所介导的信号通路也逐渐清晰。近年来，我国畜牧业不断改革发展，生产规模日益壮大，总产值已突破2.9万亿元，畜禽养殖过程中对常见疫病的防控和监测已然成为必不可少的一环。DNA病毒如伪狂犬病毒、圆环病毒、细小病毒、马立克病毒等都对畜牧养殖业有潜在威胁，特别是2018年席卷中国的非洲猪瘟病毒，对我国养猪业产生了极大的影响。在这种背景下，引发畜禽疾病的常见病原如何通过DNA感受器诱发的天然免疫研究显得尤为重要。本文着重介绍了几种DNA感受器在畜禽疫病方面的研究进展，目前这些DNA感受器的抗感染研究还停留于少数病原和有限种类细胞层面，其诱发天然免疫的详细机制以及在动物整个机体层面是否也能发挥作用需要进一步验证，大量研究空白有待填补。