日本血吸虫融合表达抗原rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2的免疫保护研究

秦芳林，李肖纯，程贵凤，吴洛滨，任雨琪，金亚美

（1中国农业科学院上海兽医研究所 农业农村部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3.山西农业大学动物科技学院，山西030800）

血吸虫病严重危害人类健康和社会经济的发展，广泛流行于亚洲、非洲和拉丁美洲[1]。血吸虫成熟雌虫大量产卵，卵堆积在宿主肝脏和肠系膜静脉形成的肉芽肿是导致宿主病理性损伤的根本原因，大量虫卵排出体外又造成血吸虫病的传播和流行。血吸虫雌雄合抱是雌虫成熟产卵的前提，未合抱的雌虫呈发育阻遏状态无法产正常卵[2]，既不会对宿主产生严重的病理损害，也不会引起该病的再传播。因此从控制血吸虫的生殖发育来防治血吸虫病具有重要意义。

ELAV-like是一类mRNA结合蛋白，含有3个高度保守的RNA识别基序RRM（RNA recognition motif），对神经系统的发育和功能维持起重要作用，且多项研究表明，RRM RNA结合蛋白在细胞代谢过程中起着重要作用，在人和其他多种生物中其表达量变化或突变会引起发育异常或导致神经性疾病的产生[3-5]。ELAV在果蝇中首次克隆获得，因其表达改变致果蝇视神经发育异常并于胚胎期死亡而得名。人类中与ELAV-like 1同源的HuR在细胞中广泛表达，通过与ARE（AU-rich element）元件结合来调节mRNA的稳定性，它的异常表达导致生长发育异常。HuR对胎盘的形态学发生和血管形成以及胎儿的维持有重要作用，该基因缺失将导致胚胎致死或发育异常[6-8]。ELAV-like 2在小鼠的生殖腺及非洲爪蟾的睾丸、卵巢和特异性的胚胎中也有表达，且研究表明，小鼠体内ELAV-like 2蛋白过早降低会导致成熟卵母细胞减数分裂效益下降[9-10]。

实验室前期研究发现ELAV-like 1和ELAV-like 2在日本血吸虫单性感染雌虫中高表达[11-12]，这预示该基因可能对日本血吸虫尤其是雌虫的生长生殖有重要影响。本研究评估了重组蛋白rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2的免疫保护效果，为血吸虫病防治研究奠定一定的数据基础。

1 材料与方法

1.1 虫株与试验动物 日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所血吸虫病研究室提供；BALB/c小鼠（6～8周龄，雄性）购于上海杰思捷试验动物有限责任公司。

1.2 主要试剂与仪器 ExTaqHS、T4 DNA Ligase、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购于宝生物工程（大连）有限公司；核酸回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、大肠杆菌感受态细胞BL21和DH5α购于天根生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 购于赛默飞世尔科技有限公司；MONTANIDEISA206VG佐剂购于赛彼科特殊化学品有限公司；TRizol购于Sigma公司；pET28a、IPTG由本实验室保存；PCR引物合成及测序由上海英俊生物科技有限公司完成。

1.3SjELAV-like 1和SjELAV-like 2全长基因的克隆、表达 根据NCBI登录的相应序列，用Primer Primier 5.0设计引物，以日本血吸成虫cDNA为模板，参考文献[1-2]，进行PCR扩增。SjELAV-like 1-F：5'-CCGGAATTCGTTGGTTCAATGTCAGA TAGTCCAT-3'（下划线处为EcoRⅠ），SjELAVlike 1-R：5'-CCGCTCGAGTTGTTGTTGTTGTCAA TGTAATCAC-3'（下划线处为XhoI），SjELAVlike 2-F：5'-GCCGGATCCATGGTTGTATATCAT GATCG-3'（下划线处为BamHⅠ），SjELAV-like 2-R：5'-CCGCTCGAGTCAGATTTTAGAGGCAG CTATA-3'（下划线处为XhoⅠ）。双酶切PCR产物及表达载体pET28a，用T4 DNA连接酶连接后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆采用菌液PCR和序列测序鉴定。将测序正确的重组克隆接种于LB培养基，D600达0.8时，加入终浓度为1 mmol/L IPTG诱导表达，分别收集0、1、2、3、4、6 h的菌体蛋白，以确定最佳诱导时间。大量表达重组蛋白经3次反复冻融，超声破碎后分别收集上清和沉淀，同时用SDS-PAGE凝胶电泳分析，判定其表达情况。将包涵体蛋白洗涤后溶于8 mol/L尿素，用His Bind Resin镍柱亲和层析法纯化。因ELAV-like 2的等电点（PI）为7.91，为防止等电沉淀，纯化rSjELAVlike 2时将所需Buffer的pH值调为8.5。

1.4 免疫 6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为实验组、佐剂对照组、空白对照组，每组10只。试验组将纯化后的融合蛋白分别与206佐剂混合（46∶54）皮下注射进小鼠体内，佐剂对照组皮下注射PBS与206佐剂混合物，空白对照组皮下注射PBS。每隔两周免疫1次，共免疫3次，ELAV-like 2免疫前和每次免疫后2周眼眶采血，收集血清用ELISA检测抗体变化水平。3次免疫后2周，每只小鼠经腹部皮肤贴片攻击感染402条日本血吸虫尾蚴。42 d后以肝门静脉灌注法收集虫体并计数，收集肝脏并分别计算肝脏荷卵数同时进行肝卵孵化，计算减卵率和减孵化率。

1.5 减虫率和减卵率的计算 减虫率=（1-实验组虫体数目/佐剂对照组虫体数目）×100%。虫卵计数：剖杀小鼠肝脏称重，置于50 mL离心管内加去氯水适量，匀浆后定容至20 mL，取1 mL匀浆液和10% NaOH等体积混合，37℃消化30 min，消化过程中不时混匀并取少量观察，待消化完全，摇匀后取50 μL于显微镜下计数虫卵，重复3次取平均值：减卵率=（1-实验组卵胚数/佐剂对照组卵胚数）×100%。虫卵孵化：取4 mL肝脏匀浆液至细颈烧瓶，加入去氯水至瓶颈上3～5 cm，液面上塞入薄层棉花（避免气泡产生）棉花上方再加入适量去氯水，26～28℃孵化，分别于孵化2 h、6 h时，将上层含毛蚴液体转移至15 mL离心管，用碘酊固定并染色毛蚴，4000×g离心5 min，弃上清液，沉淀用去氯水定容至2 mL，取50 μL显微镜下计数毛蚴，重复3次取平均值。孵化率=（毛蚴总数/卵胚总数）×100%

减孵化率=（1-实验组孵化率/佐剂对照组孵化率）×100%

2 结果

2.1SjELAV-like-1和SjELAV-like-2基因的克隆表达和蛋白纯化 以日本血吸虫成虫cDNA为模板，扩增基因SjELAV-like-1和SjELAV-like-2的已知编码区域，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示单一条带，分子量与已知序列大小相符（图1）。经双酶切连接转化测序成功后，诱导蛋白表达，SDS-PAGE结果显示，重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，二者都在4 h表达量最高，且蛋白都以包涵体的形式存在；用His-bind镍柱亲和层析法获得融合表达蛋白，分子量分别约为62 kDa和64.2 kDa，见图2-4。

2.2 免疫小鼠后特异性抗体水平变化 分别在免疫前、1免、2免、3免后2周收集小鼠血清，用ELISA方法对rSjELAV-like 2特异性IgG水平进行检测。结果发现：实验组与佐剂对照组相比，1免后特异性IgG已产生，2免后特异性抗体水平显著提升、3免后特异性抗体持续升高（图5），而差异极显著（p<0.01），具有统计学意义。佐剂对照组与空白对照组无显著性差异。

2.3 免疫保护效果 剖杀小鼠后，静脉灌注冲虫，收集虫体并计数；小鼠肝脏匀浆并孵化虫卵，显微镜下计数虫卵和毛蚴，分别计算减虫率、减卵率、减孵化率（表1）。结果显示：rSjELAV-like 1免疫可产生减虫率17.81%，减卵率44.52%，但该免疫反而提升了虫卵孵化能力（20.38%）；rSjELAV-like 2免疫可产生减虫率36.03%，减卵率为51.34%，减孵化率为46.83%。

3 讨论

血吸虫病历史悠久、分布广泛、危害严重。对血吸虫病的治疗主要依靠化学药物如：吡喹酮，但因血吸虫中间宿主钉螺难以消灭，化学药物治疗不能解决重复感染，因此加强血吸虫病免疫预防研究极为重要。

图3 融合蛋白表达形式的SDS-PAGE检测Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression

图4 融合蛋白rSjELAV-like 1和 rSjELAV-like 2纯化后产物SDS-PAGE检测Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified rSjELAV-like 1 and rSjELAV-like 2

图5 rSjELAV-like 2免疫后小鼠特异性IgG水平变化Fig.5 Analysis of specific IgG induced in mice immunized with rSjELAV-like 2

ELAV-like家族基因编码RNA 结合蛋白，通过转录后调节影响 mRNA 的转运、定位和翻译，控制蛋白的时空表达，并调控 RNA 与蛋白质的结合及其相互作用，决定基因的表达水平及终产物，进而发挥不同的生物学功能[3-4]。ELAV-like 1可通过转录后调控机制限制神经突触的生长，对神经系统的发育和维持有重要作用[13]。ELAV-like 2与Sxl基因表达转录后的调控机制及其相似，Sxl是果蝇性别发育决定的调节开关，与果蝇的性别决定和维持有很大的关系[14-15]。而日本血吸虫的ELAV-like 2与果蝇的Sex-lethal（Sxl）蛋白有一定的同源性，由此可推测SjELAV-like 2在血吸虫的生长发育中应也有同样重要的功能。本实验室前期研究发现SjELAV-like 1和SjELAV-like 2在25天的单性感染血吸虫雌虫中高表达，二者主要表达于血吸虫体表，且其表达受干扰不仅引起形态结构的改变而且对血吸虫的生殖产卵能力和卵胚孵化能力都有显著的影响[11-12]，说明二者对血吸虫尤其是雌虫的生长和生殖发育有一定的影响。

表1 融合蛋白免疫BALB/c小鼠引起的免疫效果分析Table 1 Protection level in BALB/c mice induced by fusion protein immunization

本研究成功克隆并融合表达了rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2蛋白，评估了这两个血吸虫雌虫生殖发育相关蛋白的免疫保护效果。免疫保护试验结果表明rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2有一定的免疫保护效果，对宿主的荷虫数有不同程度的降低，且rSjELAV-like 2减虫效果优于rSjELAV-like 1，同时它对减轻宿主肝脏的卵荷也显著优于rSjELAVlike 1。对宿主体内雌虫所产虫卵孵化能力上这两个蛋白表现出相反的影响，rSjELAV-like 1免疫反而会提升卵胚孵化能力，rSjELAV-like 2免疫则会降低卵胚孵化能力。

日本血吸虫成熟雌虫日产卵量可达3000个，卵沉积在宿主肝脏中会形成肉芽肿，破坏肝组织，造成宿主严重病理损害；虫卵排出体外又会造成血吸虫病的传播和流行[16]。因此减低宿主卵荷和降低虫卵孵化对血吸虫病病理损害的减轻和传播的阻断具有重要意义。rSjELAV-like 2免疫不仅能降低宿主肝脏中虫卵数目，而且降低虫卵孵化能力；rSjELAVlike 1免疫能降低宿主肝脏虫卵数目，但对虫卵孵化能力反而是提高的。二者都对宿主肝脏虫卵孵化有一定影响，都可以降低宿主体内虫荷和宿主肝脏卵荷，对减轻宿主病理损害有一定的帮助，且rSjELAV-like 2免疫可显著降低宿主肝卵孵化，在阻断血吸虫病传播方面可发挥一定作用，更适合作为抗血吸虫病疫苗候选分子。