河北省部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查与分析

刘利莎

（望都县动物疫病预防控制中心，保定072450）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染所引起的一类常见的肠道传染病[1]。PEDV可感染各发育阶段猪群，但感染哺乳仔猪可引起严重的临床症状，如呕吐、腹泻、脱水等，并导致高死亡率（约100.0%），给我国养猪业造成巨大的经济损失[2]。PED首次于1970年在欧洲被报道，其后该病在我国也有被报道，但多为散发[3]，直至2010年，我国大部分地区相继暴发PED，仔猪出现高发病率和高死亡率，给养猪业造成严重的经济损失。进一步研究显示，引起PED暴发的毒株为变异株，传统的PEDV CV777病毒株疫苗对PEDV变异株的防控效果较差，使得部分免疫PEDV疫苗的猪场仍暴发PED[4]。

PEDV为有囊膜正链RNA病毒，属冠状病毒科，基因组全长为28 kb左右。PEDV可编码7种蛋白（3种结构蛋白和4种非结构蛋白），其中S基因所编码的糖蛋白可介导病毒入侵，并对宿主产生中和抗体至关重要。S基因分为S1区和S2区，分别编码S1蛋白（1～789位氨基酸）和S2蛋白（790～1383位氨基酸）。大量研究表明，S1基因包含多个病毒的中和表位和受体结合区域[5]，与S2基因相比，S1基因更具遗传变异性[6-7]，通过分析PEDV分离株S1基因遗传变异性可以部分了解该毒株的变异情况。因此，本研究于2016年4月至2017年10月在河北省部分地区采集猪腹泻粪便样品共327份，检测PEDV流行情况，并对部分PEDV分离株的S1基因进行扩增与分析，旨在初步了解PEDV遗传变异情况，为该地区PED的防控提供基础数据借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品 2016年4月至2017年10月河北省部分地区（保定市、张家口、廊坊和沧州市）规模化猪场送检猪腹泻粪便样品共327份，将样品逐一标记后保存于-80℃，待检。

1.2 主要试剂 2×Taqmix PCR试剂、DL2000 DNA marker、琼脂糖粉和50×TAE缓冲液均购自生工生物工程（上海）有限公司；Trizol试剂、cDNA反转录试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 样品处理与RNA提取 将粪便样品与灭菌PBS缓冲液以1∶3混合均匀，反复冻融3次后，于4℃、13 000×g离心10 min。取适量上清液按Trizol法步骤提取RNA；将RNA沉淀溶解于无RNA水中，按照cDNA反转录试剂盒说明书将获得的RNA反转录为cDNA样品。

1.4 RT-PCR检测 参考文献[8]，设计检测PEDV的引物M1和M2，确定送检样品中PEDV的流行情况；同时设计并合成扩增PEDV分离株的S1基因全长序列的引物，S1-F：5'-ATGAAGTCTTTAACT TACTTC-3'，S1-R：5'-AATACTCATACTAAAGT TGGTG-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR体系（20 μL）：2×Taqmix PCR试剂10 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 pmol/L），模板2.0 μL，无RNA酶水6.0 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性1 min；56℃退火30 s；72℃延伸20s（M基因扩增引物）/90s（S1基因扩增引物），共30个循环；72℃再延伸7 min。

1.5 PEDV分离株S1基因序列分析 应用DNAStar软件对获得的序列进行拼接，同时分析本次获得的序列与参考毒株的核苷酸和氨基酸同源性。通过MEGA7.0软件中的NJ法构架系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 河北省部分地区猪腹泻样品PEDV核酸检测结果 自2010年我国出现PEDV变异株以来，PED在我国大部分猪场广泛流行，造成仔猪大量发病与死亡，为养猪业带来严重经济损失，是阻碍我国养猪业发展的重要传染病之一[9-10]。为了初步分析保定市及周边地区PED流行情况，本研究于2016-2017年收集的327份猪腹泻粪便样品，应用RT-PCR技术检测PEDV感染情况。部分检测结果显示，被检样品预期片段大小为200 bp左右，327份被检粪便样品中有84份检测为PEDV阳性，阳性率为25.08%（表2），高于张若曦等[11]检测结果（13.89%），这可能与调查样品数量和区域差异有关；而与江苏（36.3%）[12]、辽宁（36.0%）[13]和福建闽西部分地区（30.37%）[14]调查结果基本一致，但低于浙江地区（64.89%）[15]，说明PED在我国流行情况较为严重，分布区域广泛。相关部门和生猪养殖企业（户）应当引起重视，加强猪场生物安全与疫病防控。此外，该地区2016年和2017年检测样品数分别为142、185份，PEDV阳性率分别为26.76%（38/142）、24.86%（46/185），阳性率差异不大。

图1 部分样品PEDV M基因扩增结果Fig.1 The PCR results of partial M gene sequences of PEDV strains

2.2 PEDV分离株S1基因序列扩增结果 在被检测的84份PEDV阳性粪便样品中随机抽取11份样品，应用引物S1-F/R引物扩增出约2200 bp的PEDV S1基因片段（图2），11个PEDV分离株分别命名为2016-BDLY-1、2016-BDWD-1、2016-BDWD-2、2016-ZJK-1、2016-LF-1、2016-CZ-1、2017-BDWD-1、2017-BDWD-2、2017-BDLY-1、2017-ZJK-1、2017-ZJK-2。

图2 11株PEDV分离株S1基因片段扩增结果Fig.2 The PCR results of the whole S1 gene sequences of 11 PEDV strains obtained here

2.3 PEDV分离株S1基因序列分析结果 作为PEDV的主要抗原基因，S1基因具有易变异的特点，可以用于PEDV毒株变异和亲缘关系等研究[3]。通过对11株PEDV分离株S1基因序列进行扩增和测序，将序列片段进行拼接后，发现本次研究获得的PEDV分离株S1基因序列大小一致，为2205 bp。通过对获得的序列进行分析，结果见表1，11株PEDV分离株核苷酸、氨基酸同源性分别为95.8%～100.0%、93.6%～100.0%，与PEDV CV777、LZC疫苗株的核苷酸同源性为89.5%～90.8%；本次获得的PEDV分离株与中国安徽株（GenBank登录号：KC210145.1）、湖北株（GenBank登录号：JX188454.1）和江西株（GenBank登录号：KU710238.1）分离的流行变异株同源性较高，分别为96.8%～97.9%、96.0%～98.3%和97.1%～99.2%，与美国流行的强毒株（GenBank登录号：KF272920.1）核苷酸同源性为96.3%～98.7%，这与谢荣辉[4]、张若曦等[11]报道基本一致。

2.4 系统进化树分析结果 基于PEDV分离株S1基因构建系统进化树，分析结果显示（图3），本研究获得的11株PEDV分离株和GenBank收录的PEDV分离株可聚为2个亚群，分别为G1和G2，其中G1和G2可以再次分为2个亚群，分别为G1-a、G1-b和G2-a和G2-b亚群，其中疫苗分离株分布于G1-a亚群，而本次研究所获得的11株PEDV分离株均位于G2亚群，与我国流行的PEDV分离株相距较近；从图中可以看出2010年后我国PEDV流行株相距较近，无明显的地理分布差异。

表1 部分PEDV毒株的S1基因序列同源性对比Table1 Homology analysis of S1 gene sequences of partial PEDV strains

图4 基于PEDV S1基因序列构建系统进化树Fig.4 Phylogenetic analysis of PEDV S1 gene sequences

本次研究通过对河北省部分地区PED流行情况和PEDV S1基因序列进行调查和分析，初步了解了PED在该地区的流行和变异情况，本研究结果将为该地区PED科学防控措施的制定与实施奠定坚实基础，从而保障该地区生猪养殖业的健康发展。