不同季节圈养岩羊肠道微生物的多样性分析

吴海丽

（上海动物园，上海 200335）

肠道微生物指的是动物肠道内复杂且动态变化的微生物群落，包括益生菌、有害菌和条件致病菌3种[1]。肠道微生物在动物出生后开始定殖，与宿主共同构成肠道的微生态系统。肠道微生态系统与宿主的营养、代谢和免疫密切相关[2]，当“宿主-肠道微生物群”系统稳态失调后，就会导致营养-免疫平衡的破坏，宿主就会产生慢性炎症反应，长期慢性炎症最终会影响动物的健康，如：食蟹猴（Macaca fascicularis）[3]、山羊（Capra aegagrus hircus）[4]及猪（Sus scrofa domestica）[5]等动物。与大多数食草动物相比，反刍动物有独特的消化特性，其肠道菌群在物种生物学中占有突出地位[6]。目前，肠道微生物已在反刍动物中被广泛研究，如海南坡鹿（Cervus eldii）[7]、秦岭羚牛（Budorcas taxicolor bedfordi）[8]、绵羊（Ovis aries）[9]、林麝（Moschus berezovskii）[10]等。动物肠道微生物的组成和多样性受多种因素的影响[11-15]，以季节为例，在林麝[16]肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门的比例随着季节的变化而波动，冬春季的Shannon指数高于夏秋季，夏秋季的Simpson指数高于冬春季，冬春季的肠道菌群多样性高于夏秋季，该研究提示季节变化会影响动物肠道微生物。

岩羊（Pseudois nayaur），隶属于偶蹄目（Artiodactyla）牛科（Bovidae）羊亚科（Caprinae）岩羊属，又名崖羊、石羊、蓝羊，是我国Ⅱ级重点保护野生动物，主要分布在我国西藏、云南、四川、青海、甘肃、宁夏、陕西和内蒙古等地。在人工圈养的条件下，岩羊胃肠道功能较弱，容易发生腹泻，尤其是季节更替时。一直以来，国内外对岩羊生态学的研究较多，涉及种群遗传分析[17]、行为[18]、生境选择[19]、食性[20]、饲养[21]、繁殖[22]等，然而岩羊的肠道微生物研究还十分有限[23]，特别是圈养条件下。本研究利用Illumina的Miseq测序平台，对圈养条件下岩羊肠道菌群的组成、菌群多样性及优势菌群的季节性变化进行了初步测定和分析。本研究结果同时也为人工圈养条件下改善岩羊肠道菌群提供了一定的理论依据，并为后续研究岩羊肠道微生物变化与疾病的关系提供非常重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象 本研究采集的粪便样品来自于上海动物园5只岩羊，年龄、性别和体重分别：为8岁、雄性、40.3 kg，6岁、雌性、25.1 kg，6岁、雌性、24.8 kg，3岁、雌性、21.5 kg，3岁、雌性、20.2 kg。圈养面积约330 m2，饲喂草料和配合饲料（5∶1），保证充足的饮水。

1.2 岩羊粪便的采样 分别在2017年春季、夏季、秋季和冬季对上海动物园的5只圈养岩羊进行新鲜粪便的采集。为减少微生物在岩羊个体内波动造成的误差，本实验分别选取早（9∶00）、中（12∶00）、傍晚（15∶00）3个时间段采集粪便，样本收集于已灭菌的EP管中，做好标记后立即放入冰盒，混合样本置于-80℃冰箱中保存，待样品采集完全后进行粪便总DNA的提取。本次实验共采集到20份新鲜的岩羊粪便，样品编号见表1。

表1 2017年不同季节采集的岩羊粪便样品Table 1 The blue sheep feces were collected in different seasons in 2017

1.3 粪便中微生物基因组DNA的提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的粪便基因组DNA提取试剂盒（DP328），按照试剂盒说明完成基因组DNA抽提后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，测定其浓度，保存于-20℃中。

1.4 PCR扩增、荧光定量 按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，341F：5'-CCTACGGG NGGCWGCAG-3'，805R：5'-GACTACHVGGGT ATCTAATCC-3'。PCR扩增程序：95℃预变性2 min；95℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共28个循环；72℃延伸7 min。将PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶纯化。PCR产物经QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega）公司定量，按照测序要求，进行相应比例的混合。

1.5 MiSeq文库构建及测序 由上海人类基因组研究中心完成。方法如下：连接“Y”字形接头；使用磁珠筛选去除接头自连片段；利用PCR扩增进行文库模板的富集；氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥 (bridge)”；PCR扩增，产生DNA簇；DNA扩增子线性化成为单链。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

1.6 生物信息分析流程 MiSeq测序得到的PE reads首先利用Mothur软件进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU进行了α多样性（ACE、Chao、Shannon、Simpson）和β多样性分析。基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。细菌百分含量为（平均值±标准差）%。

2 结果

2.1 样品OTU稀释曲线 基于目前高通量测序技术及环境样品的物种复杂性，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理。结果显示，所有样品的稀释曲线已经趋于平缓（图1），说明本次实验的数据量可靠。

图1 样品在OTU=0.03情况下得到稀释曲线Fig.1 The dilution curve of samples at OTU=0.03

2.2 不同季节岩羊肠道菌群的结构与组成 分析岩羊在不同季节肠道菌群的结构与组成，共获得25个门、264个属。在门水平，厚壁菌门（Firmicutes）（72.73±5.84）%和拟杆菌门（Bacteroidetes）(16.61±4.37)%构成了优势菌门，其余菌门丰富度较低。在属水平，选取TOP20的菌属（去除unclassified）进行研究。Clostridium_XIVa（5.99±2.10）%、Bacteroides（2.62±0.96）%、Clostridium_IV（2.42±1.00）%和Alistipes（1.80±0.78）%共同构成了岩羊肠道菌群中的优势菌属（图2）。

2.3 岩羊肠道菌群多样性分析 肠道菌群多样性分析主要包括α多样性和β多样性。α多样性用来衡量个体内菌群多样性，如ACE、Chao、Shannon和Simpson指数。ACE和Chao指数用以评估样品的稀有物种，值越大说明稀有物种越多；Shannon值越大，Simpson值越小，则说明多样性越多。图3所示，夏季的ACE、Chao和Shannon指数的平均值分别是51568.29、24723.80和6.72，均高于其他季节，Simpson值最低，平均是0.0074，其中ACE和Chao指数的变化具统计学意义，这说明夏季的肠道菌群丰富度显著高于其他季节。秋季和冬季之间的ACE、Chao、Shannon和Simpson指数的差异无统计学意义，这说明岩羊在这两个季节的肠道菌群丰富度和多样性均无显著性差异。冬春季节之间的Simpson指数虽然无统计学意义，但有意思的是，春季ACE、Chao、Shannon指数分别是20617.81、10930.16和5.56，均显著低于冬季（40745.22、19901.95和6.33）。由此可见，春季是岩羊肠道菌群丰富度和多样性最低的季节，且具统计学意义。

图2 岩羊在不同季节的菌群分布Fig.2 The distribution of intestinal microorganism of blue sheep

图3 不同季节岩羊肠道微生物α多样性分析（P＜0.05）Fig.3 The α diversity of intestinal microbial of blue sheep in different seasons（P＜0.05）

为进一步研究季节对肠道菌群组分多样性的影响，我们利用非度量多维尺度分析法（NMDS）研究了岩羊肠道菌群的β多样性（图4）。四个季度的样本中，春季的所有样品间距离更近，单独居为一簇，而夏、秋和冬三季的样品相互重叠。这说明春季岩羊肠道菌群的组分是明显区分与其他三个季节的。NMDS分析的 stress 值为0.143，表明排序结果相对可靠。

图4 不同季节岩羊肠道微生物β多样性分析Fig.4 The β diversity of intestinal microbial of blue sheep in different seasons

2.4 不同季节岩羊肠道优势菌群的趋势图 在门水平，Firmicutes和Bacteroidetes在春夏秋冬中对应的组分分别是（66.82±12.44）%、（79.35±2.22）%、（6 8.9 6±4.7 3）%、（7 5.7 9±4.4 0）%和（1 5.0 8±5.9 5）%、（1 2.8 0±3.1 2）%、（22.89±4.41）%、（15.66±6.35）%（图5）。在属水平，Clostridium_XIVa在春夏秋冬中对应的组分分别是（8.85±2.39）%、（4.16±0.60）%、（4.72±1.05）%和（6.22±1.51）%；Bacteroides在四季中对应的组分分别是：（1.85±1.63）%、（1.7 9±0.6 5）%、（3.7 2±0.8 5）%和（3.12±1.40）%；Clostridium_IV所对应的组分分别是（1.25±0.72）%、（3.61±0.53）%、（2.09±0.53）%和（2.72±1.26）%；Alistipes所对应的组分分别是（1.92±1.10）%、（1.44±0.49）%、（2.83±0.84）%和（1.01±0.46）%（图6）。其中春夏两季，Clostridium_XIVa下降了52.99%（P值为0.0028），Clostridium_IV上升了1.89倍（P值为0.0004），变化具有统计学意义。夏秋两季，Clostridium_IV、Alistipes和Bacteroides这三个菌属差异显著，Clostridium_IV下降了42.11%（P值为0.0019），Alistipes和Bacteroides分别上升了96.53%和1.08倍（P值分别为0.0126和0.0038）。从秋季到冬季，Alistipes这个菌属下降了64.31%（P值为0.0027），且差异呈显著变化。由此可知夏秋季节更替时岩羊肠道优势菌属变化最大。

图5 岩羊优势菌门在不同季节的趋势图Fig.5 The trend diagram of the dominant bacteria (at the phyla levels)

图6 岩羊优势菌属在不同季节的趋势图Fig.6 The trend diagram of the dominant bacteria (at the genera levels)

3 讨论

3.1 岩羊肠道菌群的结构与功能 本文采用MiSeq测序平台，通过对不同季节的圈养岩羊肠道菌群进行初步研究，结果表明岩羊肠道的优势菌群主要包含了2个细菌门：厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。大量研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门普遍存在于反刍动物或其他动物胃肠道，并且是主要的优势菌门[24-25]。厚壁菌门是促进宿主胃肠道微生物分解纤维素的最主要菌群[26]，拟杆菌门是促进宿主降解寡糖的最主要菌群[27]。在草食性动物的消化系统中，厚壁菌门和拟杆菌门均扮演着重要的作用。本研究中发现，在本园圈养的岩羊厚壁菌门含量为(72.73±5.84) %，拟杆菌门含量为(16.61±4.37)%，与以往的研究相比[23]，厚壁菌门含量明显偏多而拟杆菌门含量又明显偏少，这可能是本园为岩羊提供的食物中所含草料比例较高造成的。为有效促进岩羊从食物中获取能量，可以适当优化草料与配合饲料的比例。在属水平的研究则发现，Clostridium_XIVa和Clostridium_IV分别是厚壁菌门中的优势菌属。Clostridium_XIVa的平均含量是Clostridium_IV的2.5倍，这说明在岩羊肠道菌群的厚壁菌门中，Clostridium_XIVa为优势菌属。有文献报道，Clostridium_XIVa具有粘附黏蛋白[28]和参与肠道代谢反应[29]等方面的功能，由此可知该菌属与岩羊的肠道健康有密切关系。

3.2 岩羊肠道中优势菌群的季节性变化 目前已在大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）[30]、非洲狮（Panthera leo）[31]、蜜蜂（Bee）[32]等动物中发现，肠道微生物会随着季节有显著性波动，尤其是在季节交替的情况下。从岩羊优势菌群变化的趋势图来看，肠道内的优势菌群存在着季节性波动。通过α多样性分析，从春季到夏季，岩羊肠道菌群丰富度和多样性均呈明显升高的趋势。其中夏季的ACE、Chao、Shannon指数分别是春季的2.5、2.26和1.2倍，且呈极显著性差异（P值分别为3.55×10-5、3.11×10-5和2.33×10-4）。这不仅说明了夏季岩羊肠道细菌丰富度与多样性明显增高，同时也暗示了随着高温而改变的肠道微生物菌群结构，有利于动物适应高温环境。从岩羊肠道菌群β多样性分析结果来看，春季与其他季节的菌群种类明显分开，而夏秋冬三季菌群种类变化不大，这可能跟上海春季特有的湿冷相关。有意思的是，从春季到夏季，作为厚壁菌门优势菌属的Clostridium_XIVa呈下降趋势，Clostridium_IV含量则明显升高，这说明在功能上Clostridium_IV可以部分弥补Clostridium_XIVa不足。现有的文献也发现，Clostridium_XIVa和Clostridium_IV都能参与代谢反应[33]。当秋季和冬季，Clostridium_XIVa的比例又开始增多时，Clostridium_IV的含量下降。作为拟杆菌门的Bacteroides和Alistipes从夏季到秋季都呈上升趋势，并在秋季达到峰值。现有文献表明，Bacteroides在维持肠道菌群结构的平衡中起着至关重要的作用[34-35]，Alistipes在提高机体免疫机能方面起到重要作用[36]。秋季气温波动较大，动物极易发生肠道疾病，Bacteroides和Alistipes的升高暗示了他们在秋季共同维持肠道生态平衡的功能。而在冬季，Bacteroides和Alistipes均呈下降趋势，这可能是因为冬季气温波动幅度相对不大（与夏秋季节更替相比）。由此可见，季节变化是影响岩羊肠道菌群结构及健康的重要因素。

综上所述，我们研究了岩羊肠道菌群的多样性，并发现岩羊肠道微生物的组成易受到季节变化的影响。本研究不仅补充了岩羊肠道微生态研究的基础资料，为岩羊的科学饲养及肠道疾病的防治提供思路，同时也为进一步保护野生动物提供了必要的理论支撑。