内蒙古包头地区大肠癌患者K-ras和B-raf基因突变

曹丽婷 岳林 邢少姬 郑连生 李晓敏 刘泽锦 马霄

(1包头医学院医学技术学院临床生物化学检验与分子诊断学教研室，内蒙古 包头 014060；2包头市肿瘤医院病理科；3包头医学院第二附属医院消化微创中心)

大肠癌(CRC)是我国重要的一个公共健康问题。目前，虽然CRC的发病机制尚不十分清楚，但K-ras基因突变在大肠癌的发生、发展中发挥着重要的作用早已被证实〔1〕。B-raf是Ras-Raf-MEK-ERK细胞信号转导通路中的一种重要转导因子，参与调控细胞内的细胞生长、分化和凋亡等多种生物学事件。近年来出现的以西妥昔单抗为代表的表皮生长因子(EGFR)单克隆抗体靶向抗肿瘤药物，能够特异性地针对K-ras基因野生型且B-raf基因不存在V600E突变的CRC患者进行治疗，提高了治疗的效果。在国内有关CRC患者K-ras和B-raf基因突变的研究中，由于受到了地域、饮食和样本量等多种因素的影响，使得研究结果存在较大差异。如范少安等〔2〕发现，K-ras基因突变频率随CRC患者年龄的增大而增加，王璇等〔3〕研究表明，CRC女性患者的 K-ras基因突变率高于男性患者。但也有研究结果并未发现K-ras基因突变与患者的性别有关〔4〕。目前尚未有关于内蒙古地区CRC患者K-ras和B-raf基因突变情况的报道。本研究旨在了解内蒙古包头地区CRC患者肿瘤组织中K-ras和B-raf基因的状态。

1 资料和方法

1.1一般资料 2015年3月至2018年12月经组织病理学确诊的632例CRC患者(包括337例结肠癌和295例直肠癌患者)，其中男367例，女265例，年龄27～87岁，平均(61.74±13.83)岁。受检者均无放、化疗史，且其1～2级亲属无CRC家族史及其他组织器官恶性肿瘤史。入选对象均为汉族，已在内蒙古包头地区居住10年以上，彼此无血缘关系。纳入对象均对本检测研究知情同意。

1.2组织DNA的提取 受检样本全部来自手术切除的肿瘤组织标本，均采用中性甲醛溶液固定及石蜡包埋。取一个1.5 ml的无菌离心管，将样本用手术刀刮取3张固定厚度约30 mg的待测物放入其中，为了将石蜡溶解要向无菌管中加入1 ml二甲苯，之后严格按照购买的试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明书提取组织基因组DNA。提取完毕后，需要用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度，符合要求者进行K-ras和B-raf基因突变的检测。

1.3K-ras和B-raf基因突变检测 根据试剂盒(北京鑫诺美迪基因检测技术科技有限公司)说明书配制K-ras基因常见7种突变类型和B-raf基因V600E突变检测的PCR反应扩增体系。突变检测PCR反应体系总体积均为25 μl，包含：样本DNA 2 μl、K-ras或B-raf基因PCR反应液12.5 μl、6.5 μl引物探针混合液及4 μl纯化水。检测反应程序共有三个阶段，第一是预变性：温度95℃，所需时间3 min，第二是变性：温度95℃，所需时间15 s，第三是退火、延伸、荧光信号采集：温度60℃，所需时间35 s。反应程序共设置40个循环。

1.4质量控制与结果判定 为了避免PCR反应有可能发生的非特异性扩增和污染，扩增反应前要启动尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)反应，UDG反应条件是37℃，2 min，1个循环；扩增反应结束后做溶解曲线，以验证PCR扩增产物的特异性。为保证结果判定的准确性，同一实验检测中必须设置阳性对照、阴性对照、内标质控品(自身质控，检测DNA提取样本是否加入)、阴性质控品(标准阴性曲线：内标通道内出现S型扩增曲线，但在靶基因通道内不出现S型扩增曲线)、阳性质控品(标准阳性曲线：内标通道和靶基因通道内均出现S型扩增曲线)，所设对照和质控品全部满足条件要求，且循环阈值(Ct值)<30时，结果方可采用。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0软件行χ2检验。

2 结 果

2.1K-ras和B-raf基因突变状态 研究人群中K-ras基因常见7种突变形式均有检出，发生K-ras基因突变237例，总体突变率为37.50%(237/632)，突变发生以单一位点为主，在总体突变中占比95.78%(227/237)，突变率最高的三个位点为:Gly12Asp 40.93%(97/237)、Gly13Asp 21.94%(52/237)和Gly12Val17.72%(42/237)；其次为Gly12ser6.33%(15/237)、Gly12Cys5.49%(13/237)、GlyAla2.53%(6/237)、Gly12Arg0.84%(2/237)。两位点同时发生突变者9例(3.80%)，两突变位点均位于12密码子,其中7例为Gly12Ser+Gly12Asp，1例为Gly12Ala+Gly12Val，1例为Gly12Ala+Gly12Ser；多位点同时发生突变者1例(0.42%)，突变位点在12和13密码子上均存在。

2.2K-ras基因突变与CRC患者临床基础参数的关系 不同肿瘤部位间K-ras基因突变率比较，结肠〔38.87%(131/337)〕与直肠〔35.93%(106/295)〕差异无统计学意义(χ2=0.580，P=0.446)；不同性别间K-ras基因突变率比较，女性〔(115/265)43.77%〕明显高于男性〔32.97%(122/367)；χ2=6.769，P=0.009〕。不同年龄间K-ras基因突变率比较，≥60岁老年患者〔43.05%(158/367)〕明显高于<60岁〔29.81%(79/265)；χ2=11.510，P=0.001〕。

2.3B-raf基因突变与CRC患者临床基础参数的关系 受检的632例CRC患者癌组织中B-raf基因发生突变21例(3.32%)。18例为K-ras基因野生型，3例为K-ras基因突变型，其中1例K-ras突变位点为Gly12ser，另1例为Gly12Asp；肿瘤部位位于结肠、女性、≥60岁老年患者B-raf基因V600E的突变率分别高于肿瘤部位位于直肠、男性、<60岁患者，但差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 B-raf基因突变状态及与CRC患者临床基础参数的关系〔n(%)〕

3 讨 论

关于CRC发病机制的研究中，目前公认的是，K-ras和B-raf基因点突变在CRC的发生与发展及指导其靶向治疗、治疗效果和预后判断等方面均具有重要作用。K-ras基因突变主要以碱基置换即点突变的形式存在，且多出现于其第2外显子的12和13位密码子，常见的突变位点包括12密码子上的Gly12Ser(GGT置换为GCT)、Gly12Val(GGT置换为GTT)、Gly12Asp(GGT置换为GAT)、Gly12Ala(GGT置换为GCT)、Gly12Arg(GGT置换为CGT)、Gly12Cys(GGT置换为TGT)和13密码子上的Gly13Asp(GGC置换为GAC)。多项关于恶性肿瘤临床药物的研究表明，K-ras基因的点突变状态与阻断介导肿瘤发生、发展的EGFR下游Ras-Raf-MAPK信号通路的单克隆抗体靶向药物的疗效具有明确的相关性〔5～8〕。早在2008年，欧美国家已经开始对CRC患者进行K-ras基因常见突变位点的检测，是否突变作为患者是否使用抗EGFR靶向药物治疗的重要指标。

B-raf基因突变主要发生在其第15外显子上激活区的第1 799位氨基酸上(碱基T突变为A)，以致由此编码的氨基酸变为缬氨酸(V600E)。B-raf基因V600E突变在人类的多种恶性肿瘤中，如肺癌、大肠癌、甲状腺癌、胰腺癌等均有不同比例的发生〔9～11〕。在2010年版美国国立综合癌症网路(NCCN)CRC临床实践指南中明确指出：K-ras基因为野生型时，需要进一步检测B-raf基因是否发生突变，如其发生了V600E突变，也不应使用抗EGFR单抗药物进行治疗。

本研究发现，包头地区受检的632例CRC患者癌组织中发生K-ras基因，B-raf基因V600E突变21例，突变率分别为37.50%和3.32%。K-ras基因这一突变率较国内同类研究比较，高于姚辉等〔4〕报道的27.08%，与王璇等〔3〕报道的突变率(38.8%)相近。B-raf基因V600E突变率高于涂露霞等〔12〕报道的1.90%，且与其结果显示的“B-raf基因V600E突变者均为K-ras基因野生型”也不相一致。本研究中还发现了K-ras基因存在两位点或多位点同时发生突变者，且突变位点在12和13密码子上均存在。这与国内较多研究〔2～4，13〕显示的“K-ras基因突变以单个位点发生，且无12和13密码子同时突变的个体”的报道有所差异。

有研究报道〔14〕在K-ras 基因突变的大肠癌中转化生长因子激酶1(TAK)1和有丝分裂原活化激酶活化蛋白(MAP4K2)的表达呈正相关，共同靶向抑制此两种蛋白可为治疗K-ras 基因突变的CRC患者提供可行思路。

此外，在有关K-ras 基因突变位点与患者预后的研究中，有研究提示12号密码子突变的预后不良〔15〕。本研究发现包头地区CRC患者K-ras基因突变发生于12密码子的共计185例(78.06%)，这些突变患者的预后如何还需进一步深入研究。