响应面法优化小鼠急性衰老模型

刘诗音 尹鹏

(1长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031；2吉林大学中日联谊医院)

建立科学的并能够用于临床研究衰老过程的动物模型，对于现阶段研究老年性相关疾病的发病机制及致病原因十分重要。衰老动物模型的建立，也是当今医药企业研发抗衰老药物、药品的安全性检查实验及药品有效性检定所必需的前提。自然衰老鼠模型具有最符合人类衰老特点的优点，但这一模型存在一些不足：如老年鼠饲养条件及时间不统一、采购价格昂贵、健康状况参差不齐，实验过程死亡率高，在个体对药物的吸收、代谢、分布上的变异性大。因此，鼠的人工衰老模型被广泛使用并通过各种方法研究其制备工艺。人工衰老鼠模型是指通过人为因素致衰老，构建符合实验要求的鼠模型〔1〕，主要方法包括D-半乳糖给药法〔2〕、β淀粉样蛋白注射法〔3〕、快速老化小鼠〔4〕、γ射线照射法〔5〕等。本文选择γ射线照射法构建衰老模型，此法是根据细胞衰老过程中的自由基理论，通过照射γ射线〔6〕，使小鼠体内的丙二醛(MDA)含量持续在一个高水平，MDA指标可以有效反映出氧化损伤的程度。随着机体年龄的增大，MDA的含量呈明显的上升趋势，所以MDA的含量与机体衰老状况显著相关。

1 材料与方法

1.1材料 二级小鼠，由长春医学高等专科学校食品药品学院提供。

1.2方法

1.2.1小鼠急性衰老模型的制作〔7～10〕体重为(18±2)g的雄性二级小鼠 45只，根据随机分组要求分为3组，每组各15 只。A 组为空白对照组，正常喂养；B组给予每只小鼠3.5 Gy 的全身照射(照射面积：25 cm×25 cm，照射源距动物的高度：100 cm，每次照射时间：90 s)，每10 d 照射1次，共5次，总计 17.5 Gy； C 组给予每只小鼠6 Gy 的全身照射(照射面积：25 cm×25 cm，照射源距动物的高度：80 cm，每次照射时间：90 s)，每15 d照射1次，共3次，总计18 Gy；所有小鼠普通饲料喂养，自由饮食，测量体重变化。饲养80 d后断头处死，取肝，并记录重量。

1.2.2MDA的检测〔11,12〕

1.2.2.1样品的制作 取样品20 μl，加入0.04 mol/L硫酸4.0 ml，加入10%磷乌酸500 μl，摇匀放置5 min后，3 000 r/min离心10 min，弃上清。加入0.04 mol/L硫酸2.0 ml，加入10%磷乌酸300 μl，摇匀放置5 min后，2 000 r/min离心10 min，弃上清。加双蒸水1 ml，0.67%硫代巴比妥酸1 ml，混匀，水浴煮沸1 h后冷却至室温，加入正丁醇4.0 ml，震荡抽提1 min，3 000 r/min离心10 min，取上清3.0 ml，测定荧光强度。

1.2.2.2标准溶液的制备 分别取1 μmol/L MDA 标准品 1.000 00 ml、0.500 00 ml、0.250 00 ml、0.125 00 ml、0.062 50 ml、0.031 25 ml，不足1.000 00 ml的，用三蒸水补足至1.000 00 ml。

1.2.2.3空白溶液的制备 取三蒸水1 ml，加入硫代巴比妥酸1 ml，50℃水浴保存至测定。

1.2.3影响小鼠肝脏MDA含量的单因素实验〔13〕

1.2.3.1辐照吸收剂量对小鼠肝脏MDA含量的影响 照射面积：25 cm×25 cm，照射源距动物的高度：80 cm，每次照射时间：90 s，每10 d 照射1次，共5次，辐照吸收剂量1.0 Gy、3.5 Gy、6.0 Gy时MDA的含量。

1.2.3.2辐照源距动物高度对小鼠肝脏MDA含量的影响 3.5 Gy 全身辐照，照射面积：25 cm×25 cm，每次照射时间90 s，每10 d照射1次，共5次，照射源距动物的高度为60 cm、80 cm、100 cm条件下MDA的含量。

1.2.3.3连续辐照时间对小鼠肝脏MDA含量的影响 3.5Gy全身辐照，照射面积：25 cm×25 cm，照射源距动物的高度：80 cm，每次照射时间90 s，每5 d、10 d、15 d照射1次共5次照射时MDA的含量。

1.2.4响应面优化〔14，15〕在单因素试验的基础上，选取辐照吸收剂量、辐照源距动物高度、连续辐照时间作为自变量，MDA含量为因变量。通过进行响应面优化建立小鼠衰老模型的最佳条件。见表1。

表1 试验因素及水平表

1.2.5数据统计与分析〔16，17〕采用Design-Expert8.0软件处理数据，根据单因素试验结果选取辐照吸收剂量、辐照源距动物高度、连续辐照时间3个因素作试验因素，以MDA的含量为响应值进行试验设计。每个实验做3次平行。通过考察F值(P<0.05)及每个具有显著性的因素，通过回归方程和响应面分析每个因素之间的交互作用是否具有显著性。

2 结 果

2.1各组小鼠一般情况 A组小鼠的体重有所增加，B组和C组的小鼠体重增长缓慢，并表现出行动迟缓、状态萎靡等现象；3只C组小鼠死亡。

2.2MDA含量变化 B组〔(12.78±1.21)mmol/mg〕、C组〔(12.31±1.77)mmol/mg〕的肝MDA含量均显著高于A组〔(9.57±1.13)mmol/mg,P<0.05〕。

2.3单因素实验

2.3.1辐照吸收剂量对小鼠肝脏MDA含量的影响 辐照吸收剂量为1.0、3.5、6.0 Gy时的MDA含量分别为(10.3±0.71)mmol/mg、(13.8±0.98)mmol/mg、(13.3±0.83)mmol/mg；在辐照吸收剂量大于1 Gy时，MDA含量随着辐照吸收剂量的增加强度不断增加，大于3.5 Gy MDA含量逐渐降低。因此在其他的反应条件确定时最佳辐照吸收剂量为3.5 Gy。

2.3.2辐照源距动物高度对小鼠肝脏MDA含量的影响 照射源距动物高度为60、80、100 cm时，MDA含量分别为(10.4±0.69)mmol/mg、(13.8±1.01)mmol/mg、(12.3±0.95)mmol/mg；辐照源距动物高度为80 cm时，MDA含量达到最高值。然而辐照源距动物高度过高或过低，MDA含量降低。所以在其他的反应条件确定时MDA含量的最佳辐照源距动物高度为80 cm。

2.3.3连续辐照时间对小鼠肝脏MDA含量的影响 连续照射时间5、10、15 d时，MDA含量分别为(12.7±0.84)mmol/mg、(14.0±1.18)mmol/mg、(12.5±0.83)mmol/mg；连续辐照时间为10 d时MDA最高。所以在其他的反应条件确定时MDA含量的最佳连续辐照时间为10 d。

2.4二次响应面回归模型的建立及显著性检验 根据表2的试验数据，对自变量编码辐照吸收剂量(X1)、辐照源距动物高度(X2)和连续辐照时间(X3)进行回归分析，并由Design-Expert8.0.5.0拟算出二次多项回归方程。

表2 响应面实验设计与结果

根据表3方差分析可得出，因素X1、X2、X3、X2X3、X12、X22及X32对MDA含量的影响极其显著(P<0.01)；因素X1X3对MDA含量的影响显著(P<0.05)；因素X1X2、X2对MDA 含量的影响不显著(P>0.05)。

表3 回归模型的ANOVA分析

影响MDA含量的因素，可根据二次多项回归方程一次项系数的大小判断依次为：辐射吸收度、连续照射时间和辐射源高度。通过以上判断可以说明，连续照射时间对MDA 含量的影响最显著。方差分析结果如表3，失拟项的P值>0.05，差异不显著，模型的F检验值为404.98，P值<0.000 1，差异性极显著，说明该模型与实际试验拟合较好，可用于对MDA 含量的理论预测。

通过响应面法优化出在辐照吸收剂量3.5 Gy，辐照面积25 cm×25 cm，辐照源距动物高度为80 cm，每次辐照90 s，连续辐照时间10 d， MDA含量达到最大值， MDA含量达到14 mol/mg。

2.5两因素交互作用分析

2.5.1辐照吸收剂量与辐照源距动物高度的交互作用 根据图4可知，当辐照吸收剂量与辐照源距动物高度发生变化时，MDA含量也随之发生变化。当辐照吸收剂量达到3.5 Gy，辐照源距动物高度约为80 cm时，MDA含量也相对最高。超过此范围，得率则下降。说明辐照吸收剂量与辐照源距动物高度过大都不会使MDA含量的增强，故本试验中辐照吸收剂量与辐照源距动物高度交互作用不显著。

图4 辐照吸收剂量与辐照源距动物高度的交互作用对MDA含量的响应面图

2.5.2辐照吸收剂量与连续照射时间的交互作用 由图5可知，当连续照射时间一定的条件下，MDA含量随辐照吸收剂量增大或减小而呈现明显增大或减小趋势。而在辐照吸收剂量一定的条件下MDA含量随连续照射时间变化略有不同。故本试验中辐照吸收剂量与连续照射时间交互作用显著。

图5 辐照吸收剂量与连续照射时间的交互作用对MDA含量的响应面图

2.5.3辐照源距动物高度与连续照射时间的交互作用 由图6可知，当辐照源距动物高度一定的条件下，MDA含量随连续照射时间长短而呈现明显的增大或减小趋势。而在连续照射时间一定的条件下MDA含量随辐照源距动物高度的变化而变化。故本试验中辐照源距动物高度与连续照射时间交互作用极为显著。

图6 辐照源距动物高度与连续照射时间的交互作用对MDA含量的响应面图

3 讨 论

本文利用γ射线照射的方法，确定小鼠衰老模型的建立条件为：辐照吸收剂量3.5 Gy，辐照面积25 cm×25 cm，辐照源距动物高度为80 cm，每次辐照90 s，连续辐照时间10 d，小鼠肝脏中MDA含量达到最大值。利用响应面法设计建模，可以有效减少试验次数。利用 Design-Export 软件进行响应面法设计试验，可深入分析小鼠衰老模型的适应性、系数之间的显著性。在提出优化试验方案的同时，更好地解决了响应面法在设计与优化试验过程中遇到的诸多问题。MDA与游离氨基结合生成脂褐素是目前比较广泛的衰老生物学标志物。现在研究阶段较为常用的致衰老模型为D—半乳糖给药法，这种方法在制备衰老模型时能够有较好的效果。但D-半乳糖给药法在实际操作中会出现工作量较大的问题，而且在注射给药时，因操作不当会导致小鼠感染或死亡。根据衰老过程中细胞衰老的自由基理论，通过γ射线长期照射小鼠，使小鼠体内产生大量自由基，引起生物膜的损伤，造成衰老。γ射线照射法可利用器具将小鼠准确固定在照射范围，对于照射剂量、辐射源高度等条件均能确定，实验过程可控性较高于D—半乳糖给药法。但实验用时较长及γ射线的安全性需要多加考虑。在数据统计过程中， SPSS统计软件无法很好地分析小鼠衰老模型的适应性、系数之间的显著性。而响应面法除了可以深入分析之外，还能优化出最佳的试验方案，所以响应面法可以在今后的实验中广泛使用。