复合酸化剂不同饲喂时间与浓度对黄河鲤生长和消化酶活性的影响

齐子鑫， 秦改晓， 王新华， 唐国盘， 郭国军

（河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州450046）

酸化剂包括无机酸、有机酸及盐类，或将有机酸及其盐类与无机酸复合作为复合酸化剂。酸化剂对鱼类的主要作用包括提高饲料的适口性，增加摄食量，降低饲料pH，刺激肠道和肝胰脏分泌更多的消化酶，提高饲料转化率，促进生长（敬婷等，2013； 尚卫敏等，2011；Sugiura 等，1998；Balamurali等，1997），抑制肠道有害微生物，促进部分矿物元素吸收，作为营养物质直接被机体吸收等（常青，1999）。酸化剂能够促进消化酶活性的增加，但其添加的最适浓度不同学者的研究结果差异较大。这可能与采用的酸化剂种类、添加浓度、鱼种类等因素有关，也与酸化剂在饲料中添加的时间长短及鱼类生长阶段相关（尚卫敏，2010）。

柠檬酸主要功能表现在促进肠道消化酶分泌，从而促进鱼类生长，也可能与肠道有益微生物乳酸菌、酵母菌增长有关（曹国文等，1992）。乳酸是机体糖酵解的终产物，柠檬酸和乳酸能显著提高血清中甘油三酯含量以及肝脏6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶活性，表明柠檬酸和乳酸参与机体的脂肪合成代谢（潘庆等，2004）。柠檬酸和磷酸可与矿物元素形成生物学效价高的络合物，提高矿物元素的利用率（常青，1999）。

因此，本文以柠檬酸、乳酸和磷酸配伍，把有机酸中的柠檬酸和乳酸与无机酸结合组成复合酸化剂，使不同酸化剂的生理功能互相补充、相互协同。试验设置7个浓度梯度和3个饲喂时间段考查各项生理生化指标，研究复合酸化剂对黄河鲤生长性能、消化酶活性的影响，确定复合酸化剂在黄河鲤日粮中的适宜添加量和最适饲喂时间，为深入研究酸化剂的作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试验材料 试验选用平均体重约（31.12±2.54）g的黄河鲤，由河南省水产技术推广站黄河鲤繁育中心提供；参照三种酸化剂最低有效量配制柠檬酸、乳酸、磷酸比例，分别占比60%、20%、20%组成复合酸化剂，酸化剂（化学纯）由广东智特奇生物技术有限公司提供，酶活力测定试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。

1.2 试验设计与分组 试验在河南牧业经济学院水产试验室水族馆进行。试验开始前用基础饲料驯养一周，正式试验时间共56 d。选取21个水族箱，每个水族箱长×宽×高为100 cm×50 cm×70 cm，养殖用水独立循环排注。同一酸化剂浓度设3个重复，每个水族箱放养黄河鲤30尾。

试验共设置7个复合酸化剂浓度梯度组，基础饲料中所添加的复合酸化剂浓度分别为0%（对照组）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，以次粉调平配比。

1.3 基础饲料营养与制备 基础饲料参照鲤营养需要设计配方，试验日粮组成及其营养水平见表1。各饲料原料粉碎后，通过孔径0.425 mm的（40目）筛，充分混合后制成2 mm直径的颗粒饲料，放置-20℃冰箱中保存备用。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）%

1.4 饲养管理 每天定时投饵3次，分别为8：00、12：00、17：00，投喂至不抢食为止，记录每箱饲料投喂数量。试验期间每天换水1次，24 h用小型气泵自动充气保持溶氧充足；水温保持在（25±2）℃，pH为8.0～8.5，溶氧5 mg/L以上，氨氮浓度小于0.2 mg/L。观察记录试验鱼健康状况及死亡情况。分别在饲喂20、40、56 d时，各浓度梯度的三个重复分别随机抽取5尾鱼称体重，摘取5尾鱼的肝胰脏、全肠等组织器官分别放入样品袋并立即在超低温冰箱（-80℃）保存备用。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 生长性能指标 记录每次摄食量 （FI），试验结束时，试验鱼禁食24 h后在空肠状态下取样称量鱼体重（W），测定相对增重率（WGR）、特定生长率 （SGR）、 饲料系数 （FCR）、 蛋白质效率（PER），计算公式如下：

相对增重率/%=（Wt-W0）/W0×100；

特定生长率/（%/d）=（lnWt-lnW0）×100t-1；

饵料系数=F/（Wt-W0）；

蛋白质效率/%=（Wt-W0）/F×P×100。

式中：W0为试验开始时鱼体重，g；Wt为试验结束时鱼体重，g；F为饲料摄入量，g；P为饲料中粗蛋白质含量，%；t为养殖试验天数，d。

1.5.2 粗酶液制备与酶活性测定 采集肝胰脏和全肠进行酶液制备。在投喂饵料后停食12 h，每组取5尾进行肝胰脏和肠道消化酶液采集。在冰盘中解剖取出全肠和肝胰脏，用4℃冷却的蒸馏水冲洗消化道内容物，并用滤纸吸干水分，并按重量体积比 1∶4加入9 mg/mL（0.9%）的生理盐水，迅速转入玻璃匀浆器，在冰浴环境中匀浆，将匀浆液置于4℃下冷冻离心15 min后，取上清液即为20%的粗酶液。将粗酶液置于-80℃超低温冰箱中冷藏保存。

蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性测定参照南京建成生物工程有限公司试剂盒使用说明进行。蛋白酶活性采用福林-酚试剂法（Folin-phenol）测定。1个蛋白酶的比活力单位定义为：pH 7.0，底物酪蛋白质量浓度 20 mg/mL，（37±1）℃条件下保温 10 min，每1 mg酶蛋白每分钟产生1 μg酪氨酸的酶量。淀粉酶活力采用碘-淀粉比色法测定。1个淀粉酶的比活力单位定义为：pH 7.0，（37±1）℃条件下保温30 min，每毫克酶蛋白中的淀粉酶能完全水解10 mg淀粉时的酶量。1个脂肪酶的比活力单位定义为：pH 7.0，（37±1）℃条件下保温 10 min，每毫克酶蛋白水解脂肪产生1 μg脂肪酸的酶量。

1.6 数据处理与统计分析 采用SPSS 19.0统计软件，对数据作单因素方差分析，若组间差异显著，则做LSD多重比较，显著水平用P＜0.05表示。

2 结果

2.1 不同浓度复合酸化剂对黄河鲤生长性能的影响 由表2可知，随着复合酸化剂添加浓度的升高，末体重、相对增重率、特定生长率、蛋白质效率呈现先上升后下降的趋势，饵料系数表现为先降低后上升的趋势。其中，复合酸化剂添加浓度为0.6%时生长性能最佳。与对照组（0%）相比，0.6%浓度梯度的个体末体重、相对增重率、饵料系数、特定生长率、蛋白质效率均表现出显著或极显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；且0.4%与0.6%浓度梯度间的末体重、相对增重率和蛋白质效率也表现出显著性差异（P＜0.05）。

表2 复合酸化剂对黄河鲤生长性能的影响

2.2 不同浓度复合酸化剂对黄河鲤消化酶活性的影响

2.2.1 不同浓度复合酸化剂对黄河鲤肠道消化酶活性的影响 与对照组相比，随复合酸化剂在日粮中添加浓度升高，各组肠道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均表现出先升高后降低的趋势，0.6%浓度梯度酶活最高（图 1-A、1-B、1-C）。其中0.2%和0.4%组肠蛋白酶活性较对照组比差异不显著，其他组与对照组比均差异显著，且与0.2%组差异显著；0.4%和0.6%组肠道淀粉酶活性与对照组比差异显著（P＜0.05），其他各组差异不显著；肠道脂肪酶活性各组间差异不显著。

2.2.2 不同浓度复合酸化剂对黄河鲤肝胰脏消化酶活性的影响 与对照组相比，随复合酸化剂在日粮中添加浓度升高，肝胰脏蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均表现出先升高后降低的趋势，其中，肝胰脏蛋白酶活性，0.2%～0.4%组呈升高趋势，0.4%组酶活最高，0.4%～1.2%组呈下降趋势，各组间差异不显著（图1-D）。肝胰脏淀粉酶活性和脂肪酶活性也表现出相似的变化趋势，0.2%～0.6%组表现为升高趋势，0.6%～1.2%组表现为下降趋势，0.6%组表现最佳，各组间差异不显著（图1-E、1-F）。

2.3 特定饲喂时间复合酸化剂对黄河鲤消化酶活性的影响

2.3.1 特定饲喂时间复合酸化剂对黄河鲤肠道消化酶活性的影响 随饲喂时间的延长，与对照组相比，复合酸化剂组肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性皆有提高。各酸化剂浓度梯度的肠道消化酶活性在饲喂20～40 d呈上升趋势，40～56 d呈下降趋势（图2-A、2-C、2-B），其中肠道蛋白酶活性在低于0.6%浓度组自20～56 d皆呈升高趋势，但高于0.6%浓度组40～56 d呈下降趋势（图2-A）。以0.6%浓度组饲喂56 d时肠蛋白酶酶活性最高。肠道脂肪酶活性以0.2%～0.4%酸化剂浓度组饲喂至40～56 d时表现为升高趋势，0.6%～1.2%酸化剂浓度组呈先升高后下降趋势，以0.6%酸化剂浓度饲喂40 d时活性最高。各酸化剂浓度梯度的肠道消化酶活性在三个测定时间点之间差异均不显著。

2.3.2 特定饲喂时间复合酸化剂对黄河鲤肝胰脏消化酶活性的影响 随复合酸化剂饲喂时间延长，与对照组相比，复合酸化剂组肝胰脏蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性皆有提高，其中0.2%～0.8%浓度组肝胰脏蛋白酶活性，0.2%～0.6%浓度组肝胰脏淀粉酶活性和脂肪酶活性变化趋势一致，饲喂至20～40 d时呈升高趋势，40～56 d时呈下降趋势（图2-D、2-E、2-F）。 但 1.2%浓度组肝胰脏蛋白酶活性表现为下降。各浓度组在不同检测时间段之间差异不显著。

3 讨论

3.1 复合酸化剂对黄河鲤生长性能的影响 本研究发现，黄河鲤末体重、相对增重率、特定生长率、蛋白质效率等生长指标随着复合酸化剂添加浓度的上升呈现先上升后下降的趋势，饵料系数表现为先下降后上升的趋势，其中以0.6%添加浓度的生长性能指标最优。本文研究结果与周克勇等（2006）在鲤饲料中添加0.64%浓度的复合酸化剂效果最佳和敬婷等（2013）在湘云鲫日粮中添加4 g/kg浓度的L-苹果酸生长最佳的结果基本一致，但与冷向军等（2001）在异育银鲫中添加0.2%～0.3%浓度柠檬酸效果最佳的结果有所不同。不同研究结果可能与复合酸和单一酸生理表观效果不同有关，也可能与试验鱼种类不同有关。

3.2 复合酸化剂对黄河鲤肠道和肝胰脏消化酶活性的影响 本试验结果表明，添加复合酸化剂可以明显促进蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，低于0.6%浓度组消化酶活性表现逐渐升高，高于0.6%组表现为逐渐降低或抑制趋势。各浓度组的肠道消化酶活性和肝胰脏消化酶活性随饲喂时间延长呈现先上升后下降的趋势，其原因可能是过量的酸进入肠道后，超出了机体调节能力，破坏了肠道环境，抑制肠绒毛的生长，对鱼类的消化道黏膜组织造成损伤，使鱼体处于应激状态，反而抑制消化酶活性；也可能与破坏消化道黏膜上皮细胞的腺体细胞的完整性，从而抑制了蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的分泌，影响机体的正常生理功能的发挥有关（李赟等，2014）。也有研究表明，黄河鲤肠道淀粉酶最适pH为6.5～7.0，肠道脂肪酶最适值为pH为 7.0～7.5（倪寿文等，1992），酸化剂的添加浓度过高或时间过长均会改变黄河鲤肠道和肝胰脏消化酶活性的最适pH范围。

本研究得到的消化酶活性变化趋势与尚卫敏（2010）和李赟等（2014）的研究结果类似。 低于0.6%浓度组消化酶活性变化趋势的研究结果，与潘庆等（2004）添加柠檬酸和乳酸可显著提高罗非鱼肠蛋白酶活性，王纪亭等（2009）添加复合酸使消化酶活性随添加浓度提高而升高的趋势结果相类似。但潘庆等（2004）采用的罗非鱼属有胃鱼类，酸化剂对蛋白酶的影响趋势更加显著。而本试验选择的研究对象为黄河鲤幼鱼，其肠道和肝胰脏消化酶分泌机制尚不完善；复合酸化剂对肠道淀粉酶活性未表现出显著影响，可能与无胃鱼对淀粉的利用率不高的生理特点有关（魏清和，2004）。复合酸化剂对肝胰脏脂肪酶的影响在0.4%和0.6%组差异显著，表明酸化剂对肝胰脏脂肪酶的影响较为明显，可能与无胃鱼对脂肪有较高的利用率有关（魏清和，2004）。

4 结论

在黄河鲤日粮中添加复合酸化剂可提高黄河鲤生长性能，且复合酸化剂可提高黄河鲤肠道消化酶和肝胰脏消化酶活性，表现为随添加浓度升高消化酶活性呈先升高后下降的变化趋势，饲喂时间40～56 d消化酶活性呈下降趋势，表明添加过高浓度复合酸化剂和超过40 d饲喂时间可抑制消化酶活性。因此，复合酸化剂在黄河鲤日粮中最佳添加浓度为0.4%～0.6%，适宜短时间阶段性饲喂。