胎儿结节性硬化的病理特点及遗传学分析

鲁才娟 鲁建央 詹欣 吴雅枫 翟洪波

结节性硬化症（tuberous sclerosis complex，TSC）是一种累及多系统的常染色体显性遗传病，包括皮肤、中枢神经系统、心脏、眼睛、肾脏和肺[1]。发病率为1/（6 000～10 000）。约90%的患者并发神经系统症状（癫痫、自闭症和智力障碍），预后往往很差[2]。TSC1和TSC2基因突变与该疾病密切相关。在2012年国际TSC大会上，TSC1和TSC2基因突变被确定为独立的诊断标准[3-4]。近年来，随着二代测序（next generation sequencing，NGS）技术的广泛，部分单基因病的产前诊断成为可能。在本研究中，我们综合应用产前诊断超声、家系全外显子检测、病理检查对超声提示心脏横纹肌瘤的胎儿进行了遗传学分析，以明确其发病原因。

1 对象和方法

1.1对象 选择2019年1月在本院遗传咨询门诊的1例孕妇，27岁，孕26+4周。产前诊断超声提示胎儿心脏多发横纹肌瘤。对该胎儿及其父母行家系全外显子检测，同时对引产胎儿心脏组织行病理检查。本研究通过医院伦理委员会批准，所涉及引产胎儿及其父母的标本均经胎儿父母知情并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1 产前超声检查 使用美国GE Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪，探头频率3.0～8.0 MHz。发现胎儿心脏肿块后，探查肿块形态、位置、数量及其与周边关系，并对心脏结构、功能等进行评价，同时随诊胎儿心率、心功能等变化。

1.2.2 家系全外显子检测 通过羊膜腔穿刺术采集羊水10 mL，4℃冰箱冷藏。父母外周血各5 mL（乙二胺四乙酸抗凝）。无菌条件下用DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司)提取基因组DNA。基于Illumina二代测序平台，采用Agilent SureSelectXTHuman All Exon V6 kit进行捕获建库，利用双末端（150 bp×2）测序的方法，完成样本的全外显子组测序，并进行Sanger测序验证。数据分析以GRCh37（hg19）基因组版本为依据，同时在1 000 Genomes Project，Genome Aggregation Database（gnomAD）；Exome Aggregation Consortium（ExAC）等数据库进行比对，预测该位点突变的意义。

1.2.3 病理检查 孕32周时，家系全外显子检测提示TSC2基因杂合突变，孕妇及家属要求优生引产。引产胎儿心脏组织标本用4%甲醛固定，常规石蜡制片，HE染色，行光镜观察，同时行免疫组化染色，抗体有Desmin、myoglobin、myogerdn、SMA，S-100。

2 结果

2.1产前超声检查结果 产前超声提示胎儿右心房内大小约3.6 cm×2.7 cm×2.7 cm的实质性高回声团（图1A），左心室内可见多个实质性高回声团，较大3个分别1.5 cm×0.9 cm×0.9 cm，1.1 cm×0.8 cm×0.9 cm，0.6 cm×0.5 cm×0.4 cm（图1B-D），边界清，回声均匀，无活动性，血流动力学未见明显改变。超声均未发现颅内、肾脏等其他部位结节性病变。

2.2家系全外显子检测结果 家系全外显子检测（封三图2）提示胎儿TSC2基因杂合突变，c.1839+2_1839+9del8，经典的mRNA剪接区域（外显子±2bp区间），且核苷酸序列高度保守，较大概率导致氨基酸序列被改变，从而产生异常的蛋白质。此变异未在相关临床病例中报道过，亦未在OMIM、Clin-Var、1000 Genomes、ExAC及GnomAD数据库中报道。父母检测未携带该基因突变，为新发突变。

2.3病理结果 心脏经甲醛固定后沿着大血管走形打开心腔，于右心房及左心室内见灰白色肿块，边界清晰，表面光滑，无包膜，切面呈灰白色、实性，质地较嫩（封三图3）。HE染色后镜下观察，瘤细胞大小不一，呈不规则形状，胞质呈清亮空泡状（封三图4A）。有些瘤细胞的嗜酸性胞质由细胞核向细胞膜方向伸展，似蜘蛛，多数空泡样变性，仅见稀疏的肌丝，称为“蜘蛛样细胞”[5]。肿瘤细胞形态温和，无明显异型性，未见核分裂象。行免疫组化染色肿瘤细胞myoglobin、myogerdn和Desmin（+），SMA、S-100（-）（封三图4B）。

3 讨论

心脏横纹肌瘤是胎儿最常见的心脏肿瘤，占所有胎儿心脏原发肿瘤的60%～86%[6]。产前超声作为早期发现心脏横纹肌瘤的首要诊断方式[7]，表现为心腔内及心包腔内实质性强回声块，边界清晰，内部回声均匀，随着心动周期有一定活动性。肿块较小者无明显血流动力学改变，较大者可阻塞流入道或者流出道，阻塞处血流流速可明显增高。通常，心脏横纹肌瘤肿瘤对心脏功能的影响较小，只有少数胎儿表现出心脏并发症。肿瘤可发生于心脏任何部位，以左心室和室间隔最常见，30%可累及心房和右心室[5]。横纹肌瘤的检出与孕周密切相关，孕中晚期检出率明显高于孕早期。本例孕妇在孕26+4周超声发现。心脏横纹肌瘤多发，最大者位于右心房，较一般的横纹肌瘤大很多，左心室可见多个小肿块。位置固定，活动幅度低，未引起血流动力学改变。该胎儿引产后，心脏组织行病理检查。大体标本为无包膜灰白色肿块，大小不等，镜检可见特征性的“蜘蛛样细胞”，行免疫组化亦证实为横纹肌瘤。

心脏横纹肌瘤与TSC密切相关，尤其是多发性心脏横纹肌瘤是TSC的强烈预测指标[8-9]。CHEN等[10]报道多发性横纹肌瘤的胎儿中有93%具有TSC1或TSC2突变。而且单发性心脏横纹肌瘤与TSC之间的相关性也很高，有71%的单发性心脏横纹肌瘤胎儿TSC基因检测呈阳性。本病例因超声提示胎儿多发心脏横纹肌瘤，行家系全外显子检测，提示TSC2基因c.1839+2_1839+9del8移码突变。这个变异位于经典的mRNA剪接区域（外显子±2bp区间），且核苷酸序列高度保守，较大概率导致氨基酸序列被改变，从而产生异常的蛋白质。根据美国ACMG变异分类指南标准，为PVS1证据。同时，这个变异未在人群基因数据库中报道，即人群频率极低，为PM2证据。同时，通过家系检测，及父母验证未携带该突变，考虑为新发突变，为PS2证据。但该位点在相关临床病例中未见报道，也未行相关功能学实验验证。结合送检者的临床表现和家系分析，依据美国ACMG变异分类指南，考虑为可能致病（PVS1+PM2+PS2）。TSC基因突变率高，Shruthi[11]等对98例TSC患者进行TSC1和TSC2基因变异检测，发现14种新的错义变异,这些新变异的致病性均通过应用不同的生物信息学工具，包括计算机辅助蛋白质建模来确定。Lin等[12]对77例TSC患者的TSC1和TSC2基因进行分析，共检测到63例（81.8%）的突变，包括18个TSC1突变和45个TSC2突变，其中新发突变占14例。

图1超声提示胎儿心腔内实质性高回声团（A：右心房内实质性高回声团；B-D：左心室内实质性高回声团）

图3引产胎儿的心脏解剖图片（可见多个横纹肌瘤）

图4横纹肌瘤组织病理图[A：HE染色后；B：免疫组化肿瘤细胞表达Desmin（+）]

TSC是一种常染色体显性遗传性疾病，由位于染色体9q34和16p13.3的TSC1基因或TSC2抑癌基因突变，影响Hamartin-Tuberin复合体功能，导致雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路过度活化[13-14]，临床表现为错构瘤导致的累及多系统的神经皮肤病变。其中85%～95%的TSC患者可有脑损伤，存在室管膜下结节或室管膜下巨细胞星形细胞瘤；80%～90%可出现癫痫，约2/3为难治性癫痫，30%～40%有智力低下或自闭症[15]。神经和精神症状的发病率和死亡率最高[16]。TSC患者表现差异大，典型表现如面部血管纤维瘤、癫痫、智力低下等在患儿生后才会出现[17]。多数TSC患者如果不及时治疗，预后不良。只有少数患者表现为轻症并预后良好[18]。目前TSC尚缺乏有效的治疗手段，也无法预测疾病的严重程度和病程。TSC在胎儿期的首要表现是心脏横纹肌瘤[19]，而其他系统的异常在胎儿期表现不明显或难以检测，且检测方法在胎儿期受到诸多限制。作为一种罕见病，全面的遗传学分析，使我们能够明确胎儿横纹肌瘤与TSC之间的关系，这些信息可以帮助医生制定围生期管理策略并降低新生儿死亡率。心脏横纹肌瘤胎儿的预后咨询不仅应包括肿瘤本身的预后，还应包括横纹肌瘤与TSC之间的关系以及TSC预后的信息，强调遗传分析的重要性。该TSC2基因新的可能致病位点的发现，不仅丰富了TSC基因数据库，为TSC的遗传学研究提供了新的依据。