补精益视片对大鼠慢性高眼压模型视神经PI3K/Akt通路MDM2、p53表达的影响

刘欢 李翔 刘红佶 袁铭悦 李祥玉

青光眼是继白内障后的世界第二大致盲性眼病[1]，高眼压为主要的危险因素，将眼压控制到靶眼压范围内是目前青光眼的主要治疗措施，可即使眼压降至正常范围内，视神经的损伤仍在继续发展，最终致视力丧失[2]。而且，临床上患者首次就诊时，病情常常均已至中晚期、视神经已明显损害。因此如何保护视神经已成为青光眼研究的重点和难点。本实验采用烙闭上巩膜静脉法[3]建立SD大鼠慢性EIOP模型，观察补精益视片对SD大鼠慢性EIOP模型视神经PI3K/Akt通路MDM2、p53表达的干预作用，探讨补精益视片对SD大鼠慢性EIOP模型视神经损害的保护机制，为补精益视片治疗青光眼视神经损害提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

健康清洁级SD大鼠30只，8～12周龄，体重160～200g，检查无外眼部疾病，瞳孔对光反射、眼压正常，无歪颈,由成都达硕实验动物有限公司提供。补精益视片(批号：20170328)，购自成都中医药大学附属医院；MDM2(批号：BIO11033)、p53(批号：BIO14497)抗体试剂盒，均由 BeacomBio公司提供；复合固定液由成都中医药大学附属医院病理科提供。

1.2方法

1.2.1实验分组及模型建立 30只SD大鼠随机分为对照组、模型组和给药组，每组10只。模型组与给药组予烙闭大鼠右眼3支上巩膜静脉造模处理，对照组予暴露巩膜上静脉但不行烙闭处理(为假烙闭)。具体方法如下：大鼠称重、固定、麻醉及消毒铺巾后，在上穹隆角膜缘剪开球结膜180°，暴露巩膜静脉，用眼科手术烙闭器烙闭角巩膜缘后3～4mm近赤道部约10、12和1钟位的3支上巩膜静脉血管，烙闭后近角膜缘端的血管充盈扩张，远角膜缘端的血管血流消失表示烙闭成功，术毕术眼涂金霉素眼膏，待大鼠苏醒后放回笼内，氯霉素眼液每天2次滴眼，连续1周。

1.2.2给药方法 造模后3天给药，对照组、模型组予3mL生理盐水灌胃；给药组以1.8 g·kg-1·d-1的标准(相当于成人剂量的20倍)予补精益视片混悬液3ml灌胃。每天同一时间灌胃1次，连续8周。每2周称大鼠体重1次，根据体重调整给药量。

1.3IOP测量

用TONO-PEN眼压计每日固定时间测量IOP。测量3组大鼠造模前、造模后即刻、造模后8周IOP。

1.4取材及固定

造模8周后以颈椎脱臼法处死大鼠，取眼球及视神经在内的组织块，放置于中性甲醛液中固定72小时后，标本采用梯度酒精脱水，石蜡包埋，选取球后2～4mm的视神经，做常规4μm连续切片，烘干备用。

1.5免疫组织化学法检测视神经MDM2、p53的表达 石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化氢室温孵育10min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)浸泡5分钟；10%的正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min，滴加适当比例稀释的MDM2或p53，37℃孵育2h，PBS洗涤；滴加生物素标记二抗工作液，37℃孵育30min，PBS洗涤；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS洗涤；DAB显色，脱水、透明、封片，显微镜观察阳性表达为棕黄色染色。每张切片随机取5个不同视野，用Mias-2000型图形图像分析仪测量视神经MDM2和p53阳性染色总面积及积分光密度、平均光密度的均值，作为该玻片的测量值。

1.6统计学方法

2 结果

2.1IOP 情况

各组大鼠造模前、造模后即刻及造模后8周IOP情况见表1。由表1可见：造模前3组眼压比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和给药组的造模后即刻、造模后8周均较造模前眼压高，差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组造模后8周与造模后即刻眼压比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而给药组造模后8周较造模后即刻眼压低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 造模前、造模后即刻及造模后8周各组大鼠眼压值统计表(单位：

2.2补精益视片对大鼠慢性EIOP模型视神经PI3K/Akt通路MDM2表达的影响

各组视神经MDM2表达的总面积、积分光密度、平均光密度结果见表2、图1。由上可知，造模后模型组和给药组视神经MDM2表达均下降，两组MDM2阳性染色总面积、积分光密度及平均光密度较对照组低，差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组MDM2阳性染色总面积、积分光密度及平均光密度与给药组相比，明显偏低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组视神经MDM2的表达情况

图1 各组视神经MDM2免疫组化阳性染色(×400)。A：对照组; B：模型组; C：给药组

2.3补精益视片对大鼠慢性EIOP模型视神经PI3K/Akt通路p53表达的影响

各组视神经免疫组化检测p53表达的总面积、积分光密度、平均光密度结果见表3、图2。由上可知，造模后模型组和给药组视神经p53均上升，两组p53阳性染色总面积、积分光密度及平均光密度均较对照组高，差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组p53阳性染色总面积、积分光密度及平均光密度与给药组相比，明显偏高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组视神经p53的表达情况

图2 各组视神经p53免疫组化阳性染色(×400)。A：对照组; B：模型组; C：给药组

3 讨论

PI3K/Akt信号通路为近年来基因调控细胞凋亡的研究热点。PI3K/Akt信号通路有促进神经元存活的作用[4-6]。国外已有实验证明PI3K/Akt信号通路对RGCs的凋亡过程起抑制作用[7]，但具体作用机理仍不清楚。研究发现，PI3K/Akt信号通路对于神经细胞的存活有着特殊的重要性。我们前期对大鼠慢性高眼压模型视网膜神经节细胞PI3K/Akt信号转导通路中p-Akt的表达进行了分析，证实了通过上调p-Akt的表达可修复和保护RGCs[8]。MDM2、p53亦为PI3K/Akt信号转导通路中的相关因子，PI3K为整个信号通路的起点，PI3K被激活后，激活后的产物与Akt的PH结构域结合，实现激活Akt，激活后的Akt使MDM2的第166位和188位丝氨酸磷酸化，增加MDM2蛋白的稳定性，促进p53降解，从而对细胞发挥作用[5]。MDM2是对细胞生长有调节作用的癌基因，对细胞有增强生存活力、延长生存期及促进增生等作用[9]。p53是人体重要的肿瘤抑制因子，具有调控细胞DNA修复和诱导细胞衰老、自噬、凋亡等作用[10]。MDM2和p53在细胞内互相制衡，MDM2抑制p53转录活性，促进p53降解；p53翻译MDM2，激活MDM2基因转录，二者形成负反馈调节。病理情况下，当MDM2减少，不能降解或抑制p53转录活性，使p53在细胞内的含量增加，导致细胞周期停滞或凋亡。

青光眼归属于中医的“五风内障”，多由风火痰虚瘀等导致气血失和、气滞血瘀、玄府闭塞、神水瘀积，日久肝肾两亏、神光衰微甚至泯灭，不睹三光而成青盲(青光眼视神经损害),故肝肾不足、脉络瘀滞为青光眼视神经损害的主要病机。补精益视片(原名益视片)，是中医眼科名家陈达夫据古方“驻景丸”加减化裁而成，由菟丝子、楮实子、枸杞子、五味子、茺蔚子、车前子、丹参、三七、青皮、木瓜组成，具有滋养肝肾、活血通络的功效，为补肾活血法的代表方。现代药理研究表明补精益视片中多种药物均含各种微量元素、氨基酸等成分，能调节免疫，保持机体内环境的平衡[11]。前期研究亦证实：补精益视片能轻度降低眼压[12]，保护SD大鼠慢性高眼压模型的RGCs[13]，抑制感光细胞凋亡，修复视网膜和提高视力[14]等。

本研究通过观察补精益视片对SD大鼠慢性EIOP模型视神经PI3K/Akt通路MDM2、p53表达的干预作用。结果发现，补精益视片能轻度降低SD大鼠慢性EIOP模型的眼压，上调视神经PI3K/Akt通路凋亡抑制因子MDM2、下调凋亡促进因子p53的表达，推测补精益视片保护青光眼视神经的作用机制可能是通过降眼压及调控PI3K/Akt通路的多个相关因子来实现的。