3类无创产前筛查平台检测胎儿染色体微缺失微重复效果分析

张春花 贺权泽 乔龙威 吴小娟 陆嘉逢 薛 莹 沈 聪 王 挺

江苏省苏州市立医院(215000)

染色体微缺失微重复(CNV)综合征可引起一系列复杂多样的临床症状[1]。目前临床上至少发现了70种疾病与这类综合征相关，其中90%～95%患者由新发引起；5%～10%患者由家族性遗传引起[2]。目前没有有效治疗手段，通过产前遗传咨询、产前检测可尽早发现问题。随着基于高通量测序技术的唐氏综合征无创产前筛查(NIPT)广泛应用[3-5]，适用范围逐步扩大至检测母体外周血中胎儿的染色体微缺失微重复[6-7]。本研究对不同NIPT平台筛查胎儿CNV的检测性能进行比较分析，探索各平台检测性能差异原因。

1 对象与方法

1.1 研究对象

对2018 年1月-2018 年10 月本院普通NIPT筛查样本实施CNV筛查。

1.2 筛查方法

孕周>12周孕妇签署知情同意书后，取10ml 外周血行NIPT。NIPT采用高通量测序技术对母血中游离DNA 进行低覆盖度全基因组测序，通过生物信息学方法对测序结果中的DNA序列片段进行重复序列去除和GC含量校正，将获得的unique reads与每条染色体进行比对并计算每条染色体的unique read数目，计算胎儿trisomy21，trisomy18，trisomy13 风险，其他常染色体三体风险，性染色体异常风险以及胎儿染色体微缺失微重复分析[8]。疑似胎儿染色体微缺失微重复阳性病例转至优生优育门诊就诊，医生向孕妇解释NIPT 结果，建议羊膜腔穿刺，并对后续的染色体核型以及基因芯片结果进行解释。

1.3 检测方法

1.3.1按不同的测序仪,本实验室有DA8600、CN500、BGI500 3类NIPT平台。母体外周血中游离DNA的高通量测序具体操作按照各平台仪器试剂要求进行，DA8600 Sequencer(Life Technologies)，CN500 sequencer(Illumina)。

1.3.2羊水细胞染色体核型分析将羊水细胞接种至含羊水细胞培养基(Chang Amnio,杭州欧亚生物技术有限公司)的细胞培养瓶，培养8～9 d后，常规收获制片并染色体 G 显带及核型分析。

1.3.3基因芯片检测使用美国Affymetrix 公司CytoScan750K 芯片进行CNV检测，杂交信息采用Affymetrix Chromosome Analysis Suite 3.0 软件进行分析。

1.3.4随访通过病历及电话等对参加NIPT筛查孕妇进行妊娠结局跟踪。

1.4 统计分析

使用SPSS统计软件进行统计学分析，采用卡方检验，当P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同测序平台测序仪质控参数

因血清学筛查高风险，有介入性产前诊断禁忌证或自愿选择NIPT的孕妇共计23170例，分别在3个检测平台行NIPT检测，DA8600 7430例、CN500 12446例、BGI500 3294例。BGI500 Sequencer(BGI)相应的质控参数见表1。

表1 不同测序平台测序仪质控参数

2.2 胎儿染色体微缺失微重复筛查概况

3类测序平台完成普通NIPT检测同时行染色体微缺失微重复筛查。筛查阳性患者给予辅助报告共79份，详见表2。阳性筛查率DA8600平台为0.38%(28/7430)，CN500平台为0.26%(32/12446)，BGI500平台为0.58%(19/3294),各平台间有差异(P=0.019)。对辅助筛查患者建议选择羊水细胞染色体核型分析或基因芯片诊断，其中DA8600平台9名孕妇、CN500平台1名孕妇、BGI500平台4名孕妇拒绝。以具有基因芯片结果样本计算，DA8600平台CNV检测的阳性预测值为4/15,CN500平台3/18,BGI500平台6/14，3类测序平台阳性预测值未见差异(P=0.108)。此外，假阳性样本所占比例DA8600平台为11/15,CN500平台为15/18,BGI500平台为8/14,3个平台的假阳性率未见差异(P=0.254)。

表2 各测序仪CNV筛查结果

2.3 基因芯片结果分析

基因芯片诊断47个样本，CNV<5Mb样本 7个，5Mb～10Mb样本2个,CNV>10Mb样本5个,其中有1个样本含有两个CNV。34个样本经由基因芯片分析诊断为染色体未见明显异常(对照组)。基因芯片结果诊断为有CNV的13个样本中(见表3)，孕妇平均年龄28.5岁(20～41)岁和平均孕周17.7周(16.3～19.7周)与对照组相比无差异(P>0.05)；孕妇体质量指数(BMI)平均20kg/m2(18.3～24.4kg/m2)与对照组有差异(P=0.03)。在13个确诊CNV的样本中，10个样本血清学筛查结果异常，异常包括临界风险、高风险、mom值异常。根据基因芯片的诊断结果，本研究中NIPT能够筛查的胎儿CNV为650kb～95Mb，位置分布于染色体2,8,9,12,14,15,16,18,22,X上。

2.4 各个平台CNV检测效能差异分析

将3个平台各项质控参数实际值进行比较，包括有效数据量、测序读长、GC%、Q20(%)、比对率(%)，重复率(%)、胎儿浓度(%)，发现各测序平台的有效数据量具有差异。有效数据量DA8600测序仪为3.94±0.76,CN500为3.58±0.44,BGI500为6.61±1.19,BGI500高于DA8600和CN500(P<0.001)。

2.5 随访

对NIPT提示CNV高风险且进行基因芯片诊断的47例样本随访结果分析，DA8600平台经基因芯片诊断为未见明显异常的11例中8例出生婴儿未见明显异常，3名孕妇尚未分娩，基因芯片结果诊断为CNV的4例中，1例胎儿携带Dup Xp22.2q23(95Mb)的孕妇继续妊娠，新生儿筛查苯丙酮数值偏高未复查，其他正常。1例携带Dup14q21.3q24.1(18.21Mb)的胎儿已被引产。1名胎儿携带Dup2q32.2q32.3(2.488Mb)的孕妇和1名胎儿携带Dup12q21.31(1.93Mb)的孕妇继续妊娠还未分娩。CN500平台基因芯片结果诊断为未见明显异常的15例样本中，1例因胎儿B超异常引产，1例胎儿股骨偏短3周继续妊娠，2例因无人接听随访电话失访，4名孕妇继续妊娠还未分娩,7例婴儿出生后健康；基因芯片结果诊断为CNV异常的3例中，1例携带Del 9p21.1(1.038Mb)胎儿出生后无肉眼可见异常，1例携带Dup22q11.1q13.33(36.24 Mb)的胎儿被引产，1例携带Dup 2p12(1.34 Mb)的胎儿继续妊娠还未分娩。BGI500平台经基因芯片结果诊断为未见明显异常的8例样本中，4例提示健康婴儿出生，4例还未分娩；基因芯片诊断为CNV异常的6例中，1例携带Dup 2q35q36.3(9.18Mb，骨骼发育异常)的胎儿和1例携带Dup14q24.3q32.2(21.843Mb，畸形)的胎儿已引产，其余4例继续妊娠还未分娩。

3 讨论

NIPT平台对T21,T18,T13筛查加权检出率和假阳性率分别为99.2%和0.09%[9]。2012年以来，普通NIPT被陆续用于CNV筛查[6，10-11]。Liu等[6]报道，NIPT对胎儿染色体微缺失微重复的阳性筛查率为4.5%，阳性预测值为73.6%。Li等[12]研究，NIPT对胎儿染色体微缺失微重复的阳性筛查率为9.4%，阳性预测值为61.1%。本研究中3类平台中BGI500的阳性筛查率(0.6%)高于其他两个平台，但低于上述研究结果；阳性预测值(42.9%)与其他两个平台没有显著差异，低于上述报道。分析这种差异可能原因：上述研究选取为因胎儿异常超声、母亲高龄而行NIPT筛查，本文选择的是特定时间内所有参加NIPT筛查人群。

本文基因芯片结果CNV阳性组BMI指数低于未见异常组，即BMI指数高者CNV检测假阳性率更高，这可能与高BMI指数群体中孕妇DNA对胎儿DNA的稀释效应有关，该稀释效应通过降低胎儿DNA浓度影响测序平台对胎儿CNV的检测效能[14]。Lo等报道，特定测序平台NIPT对CNV的检出能力与4个因素相关，即CNV的大小和位置，胎儿DNA浓度，unique read number[13]。证实unique read number越大，对CNV的检出性能越好。本文分析发现BGI500平台的unique read number平均值高于其他两个平台，筛查阳性率也高于DA8600平台和CN500平台，与上述文献结论一致。此外，本研究NIPT筛查出的阳性样本在诊断过程中，羊水核型分析<5M的CNV结果均未显示异常，与文献报道一致[15]。因此如果不考虑诊断染色体上DNA片段易位倒位等异常，针对NIPT筛查结果显示<5M的CNV，选择基因芯片或其他分辨率更高的诊断方法更合理。

随访结果分析，并非所有的CNV均可致病或严重致畸致残。CNV根据临床意义可定义为良性、可能良性、可能致病、病理性[14]。对一例胎儿携带Del 9p21.1(1.038Mb)(可能致病CNV)的随访发现，婴儿出生后健康。另外有报道没有T21、T18、T13、性染色体异常或CNV异常者，随访仍有一定比例孕妇因B超结果异常而引产，或不明原因流产，可能与CNV或他染色体异常的漏筛相关[16]。因此，相较于T21,T18,T13筛查，普通NIPT应用于胎儿CNV筛查时阳性预测值较低，假阴性假阳性率较高，在遗传咨询中医生应充分告知孕妇。结合2016年相关指南要求[10]，NIPT适用于CNV筛查时，除了应告知孕妇假阴性、假阳性可能，应建议CNV特别是致病性CNV筛查阳性的孕妇应进行诊断检查。

综上所述，用于T21,T18,T13产前筛查的普通NIPT对CNV具有一定预测价值，提高测序平台unique read number将是提高CNV筛查效能的一个方向。医生在遗传咨询过程中应充分告知孕妇普通NIPT在CNV筛查上的阳性预测值及可能出现的假阴性或假阳性情况。CNV筛查阳性者需通过产前诊断才能确诊胎儿是否携带染色体微缺失微重复，对确诊的CNV需充分告知CNV致病性及其外显率和表型差异以便孕妇做出更合理选择。随着测序技术的进步和成本降低，改进后的NIPT平台将以更好的CNV筛查效能服务于产前检查。