环状RNA Amotl-1对内皮克隆形成细胞影响妊娠期糖尿病早产的调控

林蒙蒙 李喜梅 徐 峰

浙江省温州市中心医院(325000)

妊娠期糖尿病(GDM)早产是妊娠期孕妇出现糖代谢异常而导致[1-3]。有研究表明环状RNA Amotl-1的表达与GDM孕妇早产的发生密切相关，且内皮克隆形成细胞(ECFCs)与环状RNA Amotl-1的表达有密切关联。探讨环状RNA Amotl-1表达和内皮克隆形成细胞影响GDM孕妇早产发生发展的机制，可为临床治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016年9月—2018年9月本院确诊为GDM早产孕妇60例作为观察组，按年龄构成与之匹配健康妊娠期志愿者10例作为对照组。排除标准：①肝炎病毒及人类免疫缺陷病毒感染；②自身免疫性疾病；③其他恶性肿瘤；④各种精神疾患。研究对象及家属均充分告知研究过程并签署知情同意书。本研究通过本院伦理委员会审核。患者均遵医嘱使用降糖药物，低糖低脂饮食，适当锻炼，及时反馈不良反应。

1.2 研究方法

1.2.1监测血糖妊娠末期检测空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPBG)及血浆糖化血红蛋白(HbA1c)含量。

1.2.2内皮克隆形成细胞血样计数收集研究对象早产14天内2次血液标本，多参数流式细胞分析仪计数内皮克隆形成细胞。

1.2.3人内皮克隆形成细胞株解冻并扩增与培养人内皮克隆形成细胞株复苏后在含10%胎牛血清的DMEM培养基中生长，培养条件为37℃、5%CO2。每1～2天换液1次，细胞生长良好，取对数生长细胞用于实验。

1.2.4siRNA设计及合成根据Gene Bank中提供的RNA-环状RNA Amotl-1序列，通过Ambion公司的在线设计工具，去除同源序列，设计3条针对RNA-环状RNA Amotl-1的特异性si RNA及1条与目的基因无同源性的对照序列。在划痕实验和小管形成实验中，选择一条最佳的环状RNA Amotl-1-si RNA进行实验。

1.2.5小管形成实验将RNA-环状RNA Amotl-1的特异性si RNA转染分为一组，将RNA-环状RNA Amotl-1质粒转染分为一组，另一组设为空白对照组。实验所用细胞提前1天用EBM-2+2%FBS青霉素/链霉素预处理，次日胰酶消化后每孔接种17000个细胞，每组均设3个复孔。每孔加100μl EBM-2+2%FBS+1%青霉素链霉素孵育培养14h后拍照。实验组加10nM维生素D3，对照组加入相应浓度乙醇。用Image J软件测量形成的小管总长度，实验重复6次。

1.2.6细胞划痕平面迁移实验将RNA-环状RNA Amotl-1的特异性si RNA转染分为一组，将RNA-环状RNA Amotl-1质粒转染分为一组，另一组设为空白对照组。内皮克隆形成细胞接种于玻片，常规培养后，无菌Eppendorf Tip在玻片上划出直径3 mm直线划痕。PBS缓冲液反复冲洗刮下的细胞，置玻片后培养箱孵育24 h。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 观察组一般情况

观察组FPG(4.38±0.57)mmol/L，2hPBG(6.47±0.54)mmol/L，HbA1c(6.26±0.46)%。60例胎儿中，出现1例宫内窘迫、1例巨大儿、2例低体重儿和1例新生儿窒息，无低血糖新生儿。

2.2 内皮克隆形成细胞比例

观察组内皮克隆形成细胞数目(99.2%)高于对照组(35.7%)(P<0.05)。

2.3 环状RNA Amotl-1的表达与内皮克隆形成细胞关系

2.3.1人内皮细胞形成管状结构能力si RNA转染组、质粒转染组和空白对照组小管长度分别为(105.17±1.34)μm、(151.62±2.51)μm和(98.56±3.71)μm有差异(P<0.05)(封三图1)。

2.3.2细胞划痕平面迁移实验24h后迁移率，对照组为5.2%，RNA-环状RNA Amotl-1质粒伤口基本愈合近100%，其次是特异性si RNA(55.9%)，各组存在差异(P<0.05)(封三图2)。

3 讨论

妊娠期糖尿病使孕妇的糖耐量受损。最新流行病学研究表明，亚洲国家GDM患病率为3.0%～21.2%[4]。随着肥胖和产妇年龄的增加，GDM的发生率呈上升趋势，也增加不良妊娠结局的风险。内皮克隆形成细胞是一种有别于经典内皮祖细胞而具有强大血管新生功能的晚期内皮祖细胞[5-7]，在心、肺、脑的缺血修复中具有强大的血管生成潜能，与GDM孕妇早产关系密切。有文献指出GDM导致子宫内高糖环境、内皮功能紊乱从而诱发早产、子痫前期、死产、新生儿死亡和先天缺陷等孕期不良结局[8-9]。本研究发现GDM孕妇的内皮克隆形成细胞数目高于非GDM的正常孕妇，分析认为ECFCs数目过高可能引发GDM孕妇早产，ECFCs可能参与了GDM孕妇早产的发生和发展。

环状RNA(circRNA)是近年来发现的一种内源性非编码RNA，在基因表达调控中发挥重要作用[10-12]，并参与动脉粥样硬化、糖尿病等多种疾病的发病机制[13-14]。Yan等人[15]发现GDM患者胎盘组织中circRNA表达异常，在GDM的发生过程中起到至关重要的作用。有报道称，circRNA可通过调节环状RNA Amotl-l加速伤口愈合[16]，所以环状RNA Amotl-l与内皮克隆形成细胞的增长密切相关。本研究结果提示，内皮克隆形成细胞数目过高可能引发GDM孕妇早产，circRNA可能通过抑制、缓冲和释放环状RNA Amotl-1，而影响内皮克隆形成细胞的增长速度而使早产发生。本研究通过环状RNA Amotl-l的si RNA以及环状RNA Amotl-l质粒的合成，利用细胞划痕平面迁移实验和小管形成实验发现，环状RNA Amotl-1可明显促进内皮克隆形成细胞生长，表明内皮克隆形成细胞的增长与环状RNA Amotl-l水平的提高有关，GDM孕妇体内内皮克隆形成细胞的高水平表达也受到环状RNA Amotl-1水平的调节。有研究发现环状RNA Amotl-1作用机制不仅包括原位调控，还存在远程调控机制[17]，它的远程调控机制在真核生物体内广泛存在，其多样的作用方式形成了对靶基因的复杂的调控通路。因此环状RNA Amotl-1在GDM孕妇早产中很可能存在远程调控机制，通过促进内皮克隆形成细胞，介导GDM孕妇早产的发生发展。

综上所述，本研究发现环状RNA Amotl-1能明显促进内皮克隆形成细胞的生长，从而调控GDM孕妇早产的发生和发展，为临床治疗GDM提供新的靶点。