MiR-92b-3p通过靶向RAD21增强非小细胞肺癌对顺铂的化学敏感性

潘有光 傅文凡 莫益俊 赵健 陈岗东

1广州医科大学附属第三医院（广州510150）；2广州医科大学附属肿瘤医院（广州510095）；3南方医科大学深圳医院（广东深圳518000）

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占所有原发性肺癌病例的80%［1］。在我国城市人口中，肺癌的发病率及病死率均居首位，且大多数NSCLC 患者确诊时已是晚期，失去手术机会。因此，化疗药物如顺铂（cisplatin，DDP）等广泛应用于一线治疗晚期NSCLC 患者［2-3］。然而，多数患者在经过化疗后会对DDP 产生耐药［4-7］，使治疗效果减弱甚至失效，导致预后不良［8］。因此，迫切需要了解NSCLC 产生DDP 耐药的分子机制，寻找新的治疗策略以克服DDP 耐药。

microRNAs（miRNAs）是一类单链、小分子非编码RNA（长度为19～25 个核苷酸），通过与靶基因的互补结合，在转录后负向调控靶基因蛋白的表达水平［9］。已经证明，大约60%的细胞蛋白编码基因是由miRNA 调控的［10］。同时，miRNA 也参与了NSCLC 的化疗耐药［11-12］。研究［13］表明，过表达miR-146a 可促进细胞凋亡，增加NSCLC 对DDP 的敏感性。miR-181c 在NSCLC 组织中上调，促进了肺癌细胞对DDP 的耐药［14］。然而，miR-92b-3p 是否在NSCLC 中介导耐药尚未明确。本研究拟阐明miR-92b-3p 在NSCLC 细胞中对DDP 耐药的生物学功能，初步发现了miR-92b-3p 可能通过调控RAD21基因的表达来介导细胞对DDP的药物敏感性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂顺铂（DDP，江苏豪森药业）；Cell Counting Kit-8（日本化学同仁研究所）；Trizol（美国invitrogen 公司）；miRNA 逆转录试剂盒（美国ABI公司）；microRNA 荧光定量PCR 试剂盒（美国ABI公司）；miRNAmimics（上海吉玛公司）；miRNAinhibitors（美国Dharmacon 公司）；双荧光素酶检测试剂盒（美国promega 公司）；一抗anti-RAD21（美国cell signaling techonology 公司）；一抗anti-β-actin（美国ProteintechGroup 公司）；二抗goatanti-mouse（美国invitrogen 公司）；cDNA 合成试剂盒及PCR 试剂盒（大连宝生物有限公司）。

1.2 细胞培养及体外顺铂耐药株的建立NSCLC亲本细胞A549由中山大学医学部提供。以A549细胞系为亲本，采用顺铂富集法逐步诱导形成A549/DDP（顺铂耐药）细胞。最终诱导药物浓度达到6 μg/mL。当细胞在6 μg/mL的顺铂中存活2个月且活性正常时，证实为耐顺铂细胞株，命名为A549/DDP。A549/DDP 培养基含有2 μg/mL 的顺铂以维持细胞的耐药性。取对数生长期细胞为实验对象。

1.3 miRNA表达的微阵列检测用总RNA纯化试剂盒分离A549 细胞和A549/DDP 细胞的总RNA。使用服务提供商（LCSciences）进行微阵列分析。使用激光扫描仪采集杂交图像，然后用Array-Pro图像分析软件进行数字化处理，比较A549 和A549/DDP的表达谱，用红色（高表达）到绿色（低表达）表示两组表达差异的比值，计算t检验的P值，P＜0.01的信号为差异检测信号。

1.4 细胞转染及药物敏感性分析miR-92b-3p mimic（miR-92b-3p）和miRNA 阴性对照（miR-NC）、miR-92b-3p inhibitor（anti-miR-92b-3p）、inhibitor 阴性对照（anti-miR-NC）分别转染至细胞株中，转染步骤按操作指南进行。24 h 后换液。然后用DDP（浓度梯度为0、3、6、9、12、15 μg/mL）继续培养48 h。加10%CCK8 培养液培养1 h 后，酶标仪测定吸收值。计算不同药物浓度下的半数抑制浓度（half inhibition concentration，IC50）值。

1.5 实时荧光定量PCR（Real time-PCR）用Trizol试剂（Invitrogen，USA）从培养细胞中提取总RNA。使用逆转录试剂盒从总RNA 中获得cDNA，合成的cDNA 在Real-timePCR 仪 检 测miRNA 和mRNA的表达水平。

1.6 荧光素酶报告系统检测利用pGL3-MCScontrol质粒进行基因3′UTR区域荧光报告基因的克隆构建。利用Primer Premier 5.0 分别设计RAD21的3′UTR 引物，克隆到报告基因载体pGL3-MCScontrol 中，构建成双荧光报告系统pGL3-RAD21-3′UTR-WT，pGL3-RAD21-3′UTR-MUT。A549 接种24 h 后，共转染miRNA mimics 或NC 对照，继续培养48 h，双荧光素酶试剂盒进行检测。

1.7 Western Blot 检测转染后，收集各组细胞，裂解液裂解细胞后收集蛋白，测量蛋白浓度后，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至PVDF膜上，封闭后2.5%脱脂奶粉的PBST 及一定比例的RAD21及β-actin抗体结合，4 ℃过夜。室温下二抗孵育1 h，最后进行曝光显影。

1.8 统计学方法统计分析采用GraphPad Prism 5 Demo 以及SPSS 18.0 软件，实验数据以表示，组间差异用one-wayANOVA 检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。所有实验重复3 次。

2 结果

2.1 miRNA 基因芯片筛选靶基因本研究使用miRNA 芯片分析比较了A549/DDP 及A549 细胞株的miRNA表达谱，发现有33个miRNA在A549/DDP细胞与A549 细胞表达上差异存在统计学意义（图1A）。图1B 列出了差异表达水平相对较高的miRNAs。值得注意的是，几个差异表达明显的miRNA（miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-92a、miR-92b 及miR-106a）包含相同的种子序列，在A549/DDP 细胞中显著下调，通过前期的一些预实验后，最终筛选出miR-92b-3p作为进一步研究的对象。

2.2 miR-92b-3p在A549/DDP细胞系中下调qRTPCR 结果显示，与A549 相比，A549/DDP 中miR-92b-3p 的表达显著下调（P＜0.01，图2A）。此外，药物敏感性试验表明，与A549/DDP 相比，A549 的耐药性明显下降。这些结果表明，异常表达的miR-92b-3p 可能与NSCLC 细胞对DDP 的耐药有关（图2B、C）。

图1 miRNA 基因芯片筛选靶基因Fig.1 Screening target genes by miRNA microarray

图2 A549 及A549/DDP 中的miR-92b-3p 相对表达量及DDP 浓度梯度下各自的IC50Fig.2 The relative expression of mir-92b-3p in A549 and A549/DDP and the respective IC50 under the concentration gradient of DDP

2.3 miR-92b-3p 可上调A549/DDP 细胞对DDP 的敏感性将A549/DDP 细胞株同时转染miR-92b-3p mimics 及miR-NC，CCK-8 结果显示，转染了miR-92b-3p mimics 的A549/DDP 细胞株IC50值显著降低，对顺铂敏感性增加。见图3。

2.4 miR-92b-3p 的下调可降低A549 细胞对DDP的敏感性将anti-miR-92b-3p 及anti-miR-NC 分别转染亲本A549 细胞，qRT-PCR 验证miR-92b-3p 在A549 细胞中的下调（P＜0.01，图4A）。CCK-8 结果显示：下调A549 细胞株中miR-92b-3p 将显著提升其对顺铂的耐药性，见图4B、4C。

2.5 RAD21 是A549/DDP 细胞中miR-92b-3p 的直接靶点本研究通过生物信息学网站对miR-92b-3p 的靶基因进行了预测和鉴定。RAD21 被预测为miR-92b-3p 的结合位点（图5A）。双荧光素酶报告基因测定显示：与共转染阴性对照相比，报告基因载体pGL3-RAD21-3′UTR 共转染miR-92b-3p mimics的荧光素酶活性显著降低；RAD21是miR-92b-3p 的一个新的靶基因（图5B）。

图3 miR-92b-3p mimics 的转染效率及转染后实验组与对照组对顺铂的敏感性Fig.3 The transfection efficiency of miR-92b-3p mimics and the sensitivity of the experimental group and the control group to cisplatin after transfection

图4 miR-92b-3p inhibitor 转染效率及实验组与对照组对顺铂的敏感性Fig.4 The transfection efficiency of miR-92b-3p inhibitor and the sensitivity of the experimental group and the control group to cisplatin after transfection

2.6 Western Blot在A549/DDP 细胞中，与miRNC组相比，过表达miR-92b-3p可抑制RAD21mRNA和蛋白质含量。反之，如果抑制A549细胞中的miR-92b-3p，可上调RAD21mRNA 和蛋白质含量。因此，这些发现表明，RAD21 可能是miR-92b-3p 的直接靶点（图6）。

3 讨论

化疗耐药性仍然是目前治疗NSCLC 遇到的瓶颈。然而，NSCLC 治疗中耐药的分子机制在很大程度上仍有待于阐明。近年来，人们认为多种分子通路参与了耐药性的形成，包括异常的药物摄取和外排、DNA 修复功能的增强、凋亡通路的中断、细胞解毒的激活等［15］。此外，有证据表明，基因和表观遗传变化，如扩增、易位、突变和组蛋白翻译后修饰也有助于化疗期间的耐药性［16-17］。最近，有研究报道，miRNAs 在获得性DDP 耐药方面发挥了关键作用，这为开发新的基于miRNA 的治疗药物克服NSCLC 的耐药带来了希望［18］。MA 等［19］发现，在前列腺癌细胞株PC-3M-2B4 中，用顺铂处理过的PC-3M-2B4 细胞株，其miR-92b-3p 的表达是下调的，而GSTM3 的表达却是上调的，表明miR-92b-3p 可以通过负向调控GSTM3 的表达而改变前列腺癌对顺铂的敏感性。

图5 miR-92b-3p 与RAD21 的3′UTR 的潜在结合点及荧光素酶活性Fig.5 Potential binding site and luciferase activity of 3′UTR of mir-92b-3p and RAD21

图6 miR-92b-3p 对A549 及A549/DDP 中RDA21 mRNA 及蛋白的影响Fig.6 Effects of miR-92b-3p on the expression of RDA21 mRNA and protein in A549 and A549/DDP

本研究中，qPCR 结果显示miR-92b-3p在A549/DDP 细胞株中的表达明显下调，表明miR-92b-3p可能参与NSCLC 的耐药。通过TargetScan、Pictar和miRBaseTargets 等生物信息学网站预测及双荧光素酶报告基因验证miR-92b-3p 的下游靶基因是RAD21。RAD21基因位于人染色体8q24.11上，其编码一种人类同源的非洲酒酵母RAD21 蛋白，是内聚蛋白复合体的关键核心成分［20］，主要功能是在有丝分裂的中后期保证染色体的正确分离［21］。同时，它还参与了染色体的同源重组及DNA 双链修复等过程［22］。研究发现，RAD21 基因的敲除可显著增强乳腺癌细胞对5-FU、环磷酰胺和依托泊苷的敏感性［23］，说明其可修复化疗药物介导的DNA 损伤。miR-92b-3p 的低表达可增强G2 期RAD21 介导的DNA 修复，减少S 期顺铂诱导的DNA 损伤，导致顺铂耐药。在本研究中，荧光素酶报告基因实验表明，在DDP 耐药的NSCLC 细胞中，miR-92b-3p 可以与RAD21 的3′-UTR 结合。过表达miR-92b-3p 可抑制DDP 耐药NSCLC 细胞株中RAD21 的mRNA 和蛋白表达。这些数据表明，miR-92b-3p 通过直接靶向NSCLC 细胞中的RAD21，高表达的RAD21 可以帮助细胞在S 期有更多的机会修复顺铂诱导的DNA 损伤，使肿瘤细胞化疗期间保持顺铂耐药性。

本研究结果显示，与DDP 敏感的亲代A549 细胞相比，A549/DDP 细胞中miR-92b-3p 的表达明显下调。恢复miR-92b-3p 可通过靶向RAD21 增加A549/DDP 细胞对DDP 的敏感性，这些发现可能为克服DDP 耐药NSCLC 的治疗提供一个有希望的生物标志物。然而必须承认，耐药是一个复杂的调控体系，本研究只是其中的冰山一角，并且验证药物单一，本课题组后续实验将进一步阐明下游的信号通路及上游与长非编码RNA 的调控关系，并在临床大样本中验证，从而为肺癌耐药机制提供新的实验依据。