lncRNA SNHG14通过miR-217-5p/FHIT分子轴抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力

鲁帅奇 杨凌博 秦帅锋 张寒 孙建涛

郑州大学附属洛阳中心医院泌尿外科（河南洛阳471009）

膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤，其恶性程度较高，具有易转移、易复发的特点［1］。传统的治疗如手术治疗、化疗等在近十几年有了较大的发展，然而膀胱癌患者整体的预后仍然较差［2］。基因水平的靶向治疗是膀胱癌研究的重要方向。长链非编码RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200 个核苷酸的单链RNA 分子，由于缺少有效的开放阅读框或包含高密度的终止子，不具有编码蛋白质的功能，长期以来被认为是没有生物学功能的转录副产物［3］。研究［4］表明，lncRNA 可在表观遗传调控、转录调控和转录后调控等多层次调控基因的表达。越来越多的lncRNA 被证实在膀胱癌发生、发展中具有重要调控作用，lncRNA 已成为膀胱癌研究领域新的热点［1］。lncRNA SNHG14 是一个新发现的lncRNA。有研究［5］表明，SNHG14 在恶性神经胶质瘤组织和细胞株中的表达明显降低，高表达SNHG14 可明显抑制神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，在神经胶质瘤中发挥抑癌基因作用。SNHG14 在膀胱癌中的表达及作用机制尚不明确。本研究旨在探究SNHG14 在膀胱癌组织和细胞株中的表达，观察高表达SNHG14 对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其分子作用机制，以期为膀胱癌的基因靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 临床标本选取本院泌尿外科于2016年11月至2019年2月行膀胱癌根治性手术切除的癌组织和相应的癌旁组织75 例，于液氮中冷冻保存，标本均经本院两名以上病理科专家确诊。患者平均年龄（54.43±8.32）岁，术前均未行放化疗。本研究经本院伦理委员会同意且患者均签署知情同意书。

1.2 细胞与主要试剂正常膀胱上皮细胞（SVHUC-1）和膀胱癌细胞株（J82、T24、5637、BIU-87）购自中国典型培养物保藏中心。DMEM/F12 培养基、RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司。SNHG14高表达质粒和阴性对照质粒购自苏州吉玛基因股份有限公司。Transwell 小室购自美国康宁公司。转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen 公司。Matrigel 基质胶购自美国BD 公司。荧光实时定量PCR（qPCR）试剂盒购自天根生化科技有限公司。二抗购自武汉博士德生物有限公司。噻唑蓝（methyl thiazol tetrazolium，MTT）试剂盒和二甲基亚砜购自南京凯基生物科技发展有限公司。一抗购自美国Cell Signaling Technology 公司。ECL 显影液购自美国Thermo 公司。

1.3 细胞培养和质粒转染J82、T24、5637、BIU-87细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，SV-HUC-1生长于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。以对数生长期的BIU-87 细胞为对象，利用LipofectamineTM3000 转染试剂，分别转染阴性对照质粒和SNHG14高表达质粒，定义为对照组和实验组。转染细胞24 h 后，更换新鲜的RPMI-1640 培养基。

1.4 RNA 提取和荧光实时定量PCR提取75 例膀胱癌组织和细胞株的总RNA，采用超微量分光光度计检测每个样品在260 nm 和280 nm 波长处的分光度值，将RNA（二者比值在1.8～2.0 之间）逆转录为cDNA。根据试剂盒说明书配制qPCR 反应体系。以U6 为内参检测miR-217-5p 的表达，以GAPDH 为内参检测SNHG14 和FHIT mRNA 的表达。SNHG14 上游引物为5′-CGTTGTCGAAAGCTAAAAGGA-3′，下游引物为5′-TGTTTCCATCTCACCAAATGC-3′；miR-217-5p 上游引物为5′-GGATGACGTAGTCCTTGA-3′，下游引物为5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；GAPDH 上游引物为5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物为5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；FHIT 上游引物为5′-ATCTCATCAAGCCCTCTGTAGT-3′，下游引物为5′-GGACGCAGGTCATGGAAGC-3′；U6 上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR参数为95 ℃预变性5 min，62 ℃25 s，72 ℃25 s，35 个循环，得到Ct 值。获得的Ct 值采用2-ΔΔCt方法计算基因表达量。

1.5 MTT 检测BIU-87 细胞增殖将转染后的BIU-87 细胞胰酶消化后接种于96 孔板，37 ℃、5%CO2培养箱培养。分别于接种后的第1、2、3、4、5天，每孔加入15 μL 浓度为5 g/L 的MTT 溶液，继续培养4 h，每孔加二甲基亚砜200 μL，振荡15 min。以空白孔调零，酶标仪测定每组细胞在450 nm 波长处的光密度（OD）值。

1.6 Matrigel 侵袭实验检测BIU-87 细胞侵袭将转染后的BIU-87 细胞胰酶消化后接种于预铺Matrigel 胶的Transwell 上室，每组均设4 个复孔。加 入600 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培养基至Transwell 下室。继续培养24 h 后，取出Transwell上室，采用多聚甲醛室温下固定10 min，采用0.1%结晶紫染液室温下染色10 min，采用棉签轻轻擦去残留细胞。高倍显微镜下拍照、计数，进入下室的细胞量代表细胞侵袭情况。

1.7 生物信息学技术预测SNHG14 作用的分子机制采用LncBase Predicted v.2 软件预测SNHG14可互补结合的miRNA，采用miRTarBase 软件预测miRNA 可互补结合的基因。

1.8 Western Blot实验检测FHIT蛋白的表达量将转染后的BIU-87 细胞胰酶消化、离心收集后，采用细胞裂解液提取总蛋白。检测蛋白浓度后根据其浓度调节上样量，于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法转移到NC 膜。将膜置于5%脱脂牛奶封闭，进一步置于一抗FHIT（1∶1 500稀释）、PI3K（1∶1 000 稀释）、AKT（1∶1 500 稀释）、p-AKT（1∶2 000）、mTOR（1∶2 000）及α-Tubulin（1∶500）在4 ℃下孵育过夜。洗膜后在二抗中孵育2 h。滴加ECL 显影液显影，α-Tubulin 为内参。

1.9 统计学方法应用SPSS 18.0 统计软件进行分析，计量数据均采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验进行分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG14 在膀胱癌组织和细胞株中低表达qRT-PCR 检测结果显示，SNHG14 在75 例膀胱癌组织中的表达量与癌旁组织相比明显下降［（1.16±0.32）vs.（5.07±0.77），P=0.003］，见图1；与正常膀胱上皮细胞相比，SNHG14在膀胱癌细胞株（J82、T24、5637、BIU-87）中的表达量明显下降（均P＜0.001），其中在BIU-87 细胞中表达最低，见图2。

图1 SNHG14 在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达量Fig.1 Expression level of SNHG14 in bladder cancer and adjacent tissues

2.2 转染SNHG14 表达质粒促进BIU-87 细胞中SNHG14 表达转染SNHG14 表达质粒后48 h，qRT-PCR 检测结果显示，实验组BIU-87 细胞中SNHG14 表达量与对照组相比明显增加［（12.65±1.46）vs.（1.00±0.05），P＜0.001］。

2.3 高表达SNHG14 抑制BIU-87 细胞的增殖MTT检测结果显示，在第3、4、5天，高表达SNHG14的实验组BIU-87细胞OD值明显低于对照组（P=0.040、0.023、0.010），表明高表达SNHG14 可抑制BIU-87细胞的增殖能力。见图3。

图2 SNHG14 在膀胱癌细胞株和正常膀胱上皮细胞中的表达量Fig.2 Expression level of SNHG14 in bladder cancer cell lines and normal bladder epithelial cell

图3 高表达SNHG14 对BIU-87 细胞增殖能力的影响Fig.3 Effect of over expression SNHG14 on the proliferation of BIU-87 cells

2.4 高表达SNHG14 明显抑制BIU-87 细胞的侵袭Matrigel侵袭实验结果显示，实验组BIU-87细胞穿过底膜的细胞数明显低于对照组［（85.03±10.41）vs.（26.37±7.69），P=0.004］，表明高表达SNHG14可抑制BIU-87 细胞的侵袭能力，见图4。

2.5 生物信息学软件预测SNHG14 作用的分子机制采用LncBase Predicted v.2 软件预测显示，SNHG14 可互补结合miR-217-5p；miRTarBase 软件预测显示，miR-217-5p 可互补结合FHIT mRNA，见图5。

2.6 高表达SNHG14对BIU-87细胞中miR-217-5p和FHIT mRNA 表达的影响qRT-PCR 检测结果显示，实验组BIU-87细胞中miR-217-5p mRNA表达量明显低于对照组［（0.19±0.02）vs.（1.01±0.07），P＜0.001］，FHIT mRNA 表达量明显高于对照组［（5.71±0.64）vs.（1.00±0.03），P＜0.001］，表明高表达SNHG14 可下调miR-217-5p 的表达，促进FHIT mRNA 的表达。

图4 高表达SNHG14 对BIU-87 细胞侵袭能力的影响Fig.4 Effect of overexpression SNHG14 on the invasion of BIU-87 cells

图5 生物信息学技术预测SNHG14 作用机制Fig.5 Bioinformatics technology predicts the mechanism of action of SNHG14

2.7 高表达SNHG14 对FHIT 蛋白表达的影响Western Blot 检测结果显示，高表达SNHG14 后，FHIT 蛋白表达量增加，PI3K/AKT 信号通路蛋白如PI3K、p-AKT 及mTOR 蛋白表达降低，提示PI3K/AKT 信号通路被抑制，见图6。

3 讨论

随着新一代测序技术的发展，lncRNA 已成为近年来非编码RNA 研究领域的热点［6］。lncRNA可通过多种方式调控基因的表达，广泛参与原癌基因或抑癌基因的上调或下调，在细胞分化、增殖、代谢、凋亡、衰老等各种生理病理活动中均具有非常重要的调控功能［7］。lncRNA 在恶性肿瘤中的差异表达和分子作用机制研究逐渐深入，越来越多的lncRNA 被发现与肿瘤的发生、发展密切相关［8］。已有一些lncRNA如ITGB1、UCA1、DUXAP10被证实在膀胱癌中发挥作用，可明显影响膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭、耐药性等恶性生物学行为，且与膀胱癌的早期诊断、复发、转移和预后判断具有相关性［9-11］。SNHG14 是一个新发现的具有抑癌基因功能的lncRNA，可通过调控miRNA 的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。本研究结果显示，SNHG14 在膀胱癌组织和细胞株中表达量均明显降低，表明SNHG14 可能在膀胱癌的发生、发展中发挥抑癌作用［5］。本研究进一步通过MTT法和Matrigel 侵袭实验发现，高表达SNHG14 可明显抑制膀胱癌细胞增殖和侵袭能力。

图6 高表达SNHG14 对BIU-87 细胞FHIT 相关蛋白表达的影响Fig.6 Effect of high-expressed SNHG14 on the expression of FHIT protein and related proteins in BIU-87 cells

lncRNA 在肿瘤中作用机制之一是“分子海绵”作用，即通过竞争性结合miRNA 并下调miRNA 的表达，干扰miRNA 对其靶基因的抑制作用［12］。生物信息技术预测显示，SNHG14 可互补结合miR-217-5p，miR-217-5p 可互补结合脆性组氨酸三联体（fragile histidine teiad，FHIT）。miR-217-5p在皮肤鳞状细胞癌和胶质母细胞瘤组织中明显高表达，正向调控肿瘤的发生、发展，促进肿瘤细胞的生长和转移，发挥明显的原癌基因作用［13-14］。本研究结果显示，高表达SNHG14 后，膀胱癌细胞中miR-217-5p 的表达明显降低，SNHG14 可能通过“分子海绵”作用下调miR-217-5p 的表达。FHIT 基因位于染色体3q14.2，由147 个氨基酸残基组成，是近年来新发现的抑癌基因。FHIT 在胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中的表达明显降低，FHIT 通过抑制PI3K/AKT 信号通路转导，可显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，其表达水平与肿瘤患者的预后明显相关［15-18］。FHIT 在膀胱癌组织和细胞株中呈低表达，且FHIT 表达水平与膀胱癌的转移、分期、分级相关，FHIT 的表达水平越高，患者生存期越长［19］。本研究结果显示，SNHG14 抑制miR-217-5p 的表达后，FHIT 基因的表达明显增加，表明SNHG14 可能通过靶向抑制miR-217-5p 的表达，促进FHIT 基因的表达。本研究进一步发现，BIU-87 细胞中FHIT 蛋白表达升高后，PI3K/AKT 信号转导通路蛋白PI3K、p-AKT 及mTOR 表达明显降低，提示PI3K/AKT 信号转导通路被抑制。

综上所述，本研究显示SNHG14在膀胱癌中表达明显降低，高表达SNHG14 可降低膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力，其分子机制可能是抑制miR-217-5p 的表达后促进FHIT 基因的表达，从而进一步阻滞PI3K/AKT 信号通路。SNHG14 可能为膀胱癌的分子治疗提供新的靶点。