单磷酰脂A佐剂的热原控制方法研究

裴宇盛，蔡 彤，陈 晨，高 华

(中国食品药品检定研究院化学药品检定所药理室，北京 102629)

细菌内毒素检查法和热原检查法是《中国药典》(2015版)[3]中收载的用于检测注射剂热原污染的方法，一般品种热原控制首选细菌内毒素检测。家兔热原检查法由于使用实验动物，并且只能定性检测无法定量给出具体数值，可作为终产品放行方法，但对生产过程中质量控制意义较小。新的体外热原检测方法[4-5](单核细胞活化实验)是根据人的发热机理而设计的一类检测方法，报告基因法本质是对单核细胞活化实验的改良。通过引入报告基因而简化实验流程。

本研究选择了人源高表达TLR2受体的HEK细胞系和人源高表达TLR4受体的HEK细胞系进行检测，并选择了细菌内毒素检查法作对照研究。参照药典要求[6]3种方法分别进行线性与范围、专属性、检测限、耐用度、回收率等方法学研究，其中以专属性为研究重点。以期为MPLA佐剂建立适宜的热原质量控制方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂细菌内毒素国家标准品(批号：150800-201601)中国食品药品检定研究院提供；动态显色法试剂盒(货号：KC-125，批号：1611182)购自湛江安度斯生物有限公司；人源高表达TLR2受体的HEK细胞系(货号：hkb-htlr2)购自美国InvivoGen公司；人源高表达TLR4受体的HEK细胞系(货号：hkb-htlr4)购自美国InvivoGen公司；合成MPLA分别购买自sigma(货号：5086PHB029，批号：69800P-5mg-B-029)和InvivoGen公司(货号：tlrl-mpls，批号：MPS-40-02)。

1.2 线性和范围

1.2.1细菌内毒素检查法 标准曲线制备：用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品，混匀15 min后，稀释制备标准内毒素溶液，每步稀释混匀不少于30 s；标准曲线范围100～104EU·L-1，稀释梯度为10(本文中标准曲线均为10倍稀释)。阴性对照制备：将内毒素标准品溶液加入酶标板，每个浓度设3个复孔，阴性对照设2个复孔，加样量均为100 μL每孔，于37 ℃孵育10 min；将鲎试剂按标示量1.25 mL溶解，立即加入酶标板中，每孔100 μL,振荡10 s；于37 ℃条件下孵育，于660 nm处每隔30 s读取一次数据，预设OD值为0.02。实验重复5次。

1.2.2人源高表达TLR2受体的HEK细胞系 当细胞覆盖率达到50%～80%时，经悬浮细胞计数后，用培养基将细胞稀释2×108个·L-1，接种到96孔板，每孔160 μL。用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品，混匀15 min后，稀释制备标准内毒素溶液，标准曲线范围100～104EU·L-1每个浓度平行3孔。在酶标板中每孔加入20 μL内毒素标准溶液，再加入20 μL的BET水。培养24 h后每孔吸取上清液20 μL至一个新酶标板中，每孔续加180 μL专用显色溶液，37 ℃孵育3 h，显色为蓝紫色，在波长630 nm下检测。实验重复5次。

为了进一步探求图式理论策略与阅读能力的关系，该研究采用逐步进入法（stepwise）对图式理论策略与阅读能力进行多元回归分析（见表3）。

1.2.3人源高表达TLR4受体的HEK细胞系 除采用细胞系为人源高表达TLR4受体的HEK细胞系，其余操作同1.2.2。实验重复5次。

1.3 专属性研究MPLA与鲎试剂的反应：取商业化生产的两批MPLA分别稀释至1 μg·L-1与鲎试剂进行反应。人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系：取商业化生产的两批MPLA分别稀释至1～10 000 μg·L-1分别与人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系进行反应，记录每一浓度响应值(OD值)。另取细菌内毒素标准品，使用内毒素检查用水，稀释至100～106EU·L-1，分别使用人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系进行反应，记录每一浓度的响应值(OD值)。

1.4 最低检测限

1.4.1细菌内毒素检查法 最低检测限为鲎试剂标识灵敏度的下限。

1.4.2人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系 最低检测限为所制备的细菌内毒素标准曲线(S 型四参数拟合曲线)的最低点浓度,该检测限所至单核细胞分泌的内热原量应不小于阈值(阴性对照的平均值加上其 3 倍的标准偏差)；若小于阈值，则将阈值对应的OD值代入上述四参数拟合曲线中，获得的浓度值即为最低检测限。

1.5 耐用度研究人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系：考察细胞代次的对实验影响，将细胞传至20代。按照1.2.2标准曲线线性和范围实验进行操作，r值应大于0.980。检测限不应降低。

1.6 回收率实验

1.6.1内毒素检查法 样品制备：将2种不同来源的MPLA用细菌内毒素检查用水进行系列稀释，细菌内毒素检查法中，2批样品在1 μg·L-1测定。样品阳性对照制备：用内毒素检查用水将细菌内毒素国家标准品进行系列稀释，每步稀释混匀不少于30 s；将内毒素标准品分别加入到2批MPLA中，使其含有内毒素含量为104EU·L-1。标准曲线制备：用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品，混匀15 min后，稀释制备标准内毒素溶液，标准曲线范围100～106EU·L-1，每个浓度平行3孔。阴性对照制备：为内毒素检查用水。

1.6.2人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系 样品制备：将2种不同来源的MPLA用细菌内毒素检查用水进行系列稀释，TLR4细胞系中，2批样品在1 mg·L-1测定。TLR2细胞系中，2批样品在0.1 g·L-1测定。样品阳性对照制备同1.6.1。标准曲线制备：用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品，混匀15 min后，稀释制备标准内毒素溶液，标准曲线范围100～ 106EU·L-1每个浓度平行3孔。阴性对照制备：为内毒素检查用水。

1.7 内毒素含量检测样品制备、样品阳性对照制备、标准曲线制备、阴性对照制备同1.6回收率试验。

1.8 统计方法

1.8.1细菌内毒素检查法 到达预设OD值的时间(Onset time)与对应的内毒素浓度进行双对数转换，以内毒素浓度对数值为横坐标，以Onset time对数值为纵坐标进行线性拟合，拟合相关系数的绝对值应大于0.980。

按中国药典内毒素检查法干扰实验项目下计算回收率，回收率在50%～200 %范围内有效。

1.8.2人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系 以内毒素浓度值为横坐标，以吸光度值为纵坐标进行四参数拟合，拟合相关系数应大于0.980。按中国药典内毒素检查法干扰实验项目下计算回收率，回收率在50%～200 %范围内有效。

2 结果

2.1 线性和范围采用3种方法进行检测，r的绝对值均>0.980，检测范围上下限及r的绝对值，详见Tab 1。

Tab 1 Results of linear range

2.2 专属性MPLA与鲎试剂反应方面，MPLA可以引起类似内毒素的响应，其响应值高达1×109EU·g-1水平，与纯品细菌内毒素的反应水平相当(参照细菌内毒素国际标准品说明书)，应为假阳性结果。MPLA专属性研究试验结果方面，MPLA对TLR2细胞系在实验浓度范围内测定值与阴性对照均无显著性差异，表明在该浓度范围内，MPLA并不会与TLR2细胞系发生反应，详见Fig 1。MPLA在1 mg·L-1以上可激动TLR4受体并产生效应。此即MPLA的免疫激活效应，详见Fig 2。内毒素专属性研究结果方面，不同纯度内毒素在不同浓度表现出对TLR2/TLR4细胞刺激结果不同。TLR2细胞对内毒素标准品在10 000～106EU·L-1范围内显示出随浓度依赖的响应，详见Fig 3。对于TLR4细胞内毒素标准品在浓度100～106EU·L-1范围内细胞显示出随剂量依赖的响应，详见Fig 4。综上所述，MPL和内毒素标准品，对鲎试剂和TLR4细胞系引起类似的响应活性，不能将两者区分；而TLR2细胞系仅对细菌内毒素标准品有响应，因此可用TLR2细胞系作为MPL的检测细胞。

Fig 1 Results of MPLA specificity test on TLR2 cell line n=3)

Fig 2 Results of MPLA specificity test on *P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 3 Results of endotoxin specificity test on TLR2 cell line n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 4 Results of endotoxin specificity test on TLR4 cell line n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.3 检测限根据“1.4.1”和“1.4.2”，内毒素检查法检测限确定为10 EU·L-1，TLR2细胞法为104EU·L-1，TLR4细胞法为100 EU·L-1。

2.4 耐用度考察细胞传代次数对实验影响，TLR2/TLR细胞系传至20代，按照“1.2.2”标准曲线线性和范围实验进行操作，r值均大于0.980。各自检测限与“2.3项”相比，均未降低。

2.5 回收率实验和内毒素检测结果结果见Tab 2。根据药典规定，回收率在50%～200 %即符合规定，其检测值即为样品的内毒素含量。

Tab 2 Results of endotoxin detection and recovery

3 讨论

实验结果显示，MPLA和细菌内毒素都能与鲎试剂发生反应。细菌内毒素一般由3部分组成，类脂A核心多糖和特异性多糖，鲎试剂与细菌内毒素的结合位点在于类脂A部分[7]。而MPLA恰恰是人工合成的类脂A结构类似物。虽然其具有相同的结合位点，但是其与鲎试剂的反应剂量依赖性却与细菌内毒素表现出很大差异，由于这种特性，类似于生物测定量反应平行线法测定中，样品与标准品产生的生物活性不同，不能用来定量。另一方面，细菌内毒素检测的目的是间接反映样品中污染的热原量，MPLA虽然能与鲎试剂发生反应，然而却不具有致热性[8]，这就使得使用鲎试剂这种方法来控制其热原污染程度失去了意义。因此表2中细菌内毒素检查法所测定结果，虽然回收率实验符合药典的规定，用来量化细菌内毒素并不准确，仅作为同浓度不同样品间内毒素含量比较参考值。

TLR4细胞法专属性结果与细菌内毒素检测专属性研究结果类似。同样存在无法确定检测值是由MPLA引起还是由于细菌内毒素引起，因此也不适合用来量化细菌内毒素含量。根据中国药典规定，细菌内毒素检查法在检测过程中，仅需要进行标准曲线可靠性验证和干扰试验，即回收率，可建立检测方法。并不进行专属性、耐用度等方面的研究。然而根据研究结果显示，MPLA会严重干扰细菌内毒素检测和TLR4细胞法准确检测出细菌内毒素。

根据Fig 2、4结果，虽然MPLA和内毒素均能够激动TLR4受体，根据细菌内毒素国际标准品的内毒素质量和效价关系，0.12 ng对应1 EU效价，可估算0.012 μg·L-1即可激活TLR4受体，明显高于MPLA(1 mg·L-1)。推测与细菌内毒素的分子大小与聚集形态更适合于结合TLR4受体。

细菌内毒素是经典的TLR4受体激动剂[9]，本实验表明细菌内毒素国家标准品同样可以激活TLR2受体。根据文献报道[10-11]，细菌中的脂蛋白，或者热灭活大肠杆菌均可以激活TLR2受体，即使TLR2受体是由非内毒素成分激活，本研究所建立的TLR2细胞检测体系仍然可以用于质控，其原因在于自然界不存在细菌内毒素纯品，在质量控制活动中出现的细菌内毒素必定为细菌死亡后的产物。TLR2细胞检测体系即为检测微生物污染间接反映热原的量。