DNMT1在SD大鼠心肌成纤维细胞增殖中的作用

丁季飞，陶 辉，石开虎，徐盛松

(安徽医科大学 第二附属医院心胸外科、心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

心肌纤维化是各种心血管疾病不可改变的病理变化过程，有助于心肌重塑[1-2]。研究表明心肌纤维化与心房颤动的发生、发展密不可分，是心房颤动发生结构重构的重要病理基础[3]。心肌纤维化主要表现为胶原沉积和心脏成纤维细胞(CFs)的积累，是心室重塑的病理学标志[4]。目前，心肌纤维化形成的具体机制尚不明确，但已发现心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)的增殖是心肌纤维化形成的关键因素[5-6]。文献报道DNA甲基化参与心肌成纤维细胞的增殖。DNA甲基化由一组保守的酶催化，称为DNMT[7]。DNA甲基化转移酶目前已知有3种，包括DNMT1，DNMT3a和DNMT3b[8]。DNMT1在肝纤维化中已报道较多，但在心肌纤维化中报道甚少[9]。本研究以DNMT1为突破点，通过观察DNMT1对CFs增殖的影响，探讨其与心肌纤维化的关系及可能作用机制，为预防及治疗心肌纤维化提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 40只清洁级Sprague-Dawley(SD)乳鼠，体质量(10±2)g，鼠龄1～3 d左右。所有乳鼠均购于安徽医科大学动物实验中心，动物许可证号：scxk (皖) 2017-001。

1.1.2试剂 DMEM培养基(美国HyClone公司，AE29005267)；DMSO、CCK-8相关试剂(美国Sigma公司,5439001000；68121000)；胎牛血清(Gibco公司,1581729)；小干扰DNMT1(siDNMT1)转染试剂盒(上海吉玛基因公司,96486)；细胞周期试剂盒(美国BD公司,9183478)；Ez Omics One-Step qPCR试剂盒；SYBR PremixExTaqⅡ(2×) (TaKaRa公司，RR820A)；TRIzol试剂(美国Life Technology公司,190906)、LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司,1718554)；DNMT1和I型胶原前胶原A1(Col1A1)的一抗(Proteintech Group,Inc.中国武汉公司,00053896;00066288)；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) (武汉博士德生物工程有限公司,1A4)、β-actin的一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，19AW0401)。

1.1.3仪器 1300 SERIES A2型生物安全柜(美国Thermo Fisher Scientific公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；CFX ConnectTM扩增仪(美国伯乐公司)；酶标仪 (美国Thermo Fisher Scientific公司)；分光光度仪(德国IMPLEN Gmb H公司)流式细胞仪CytoFLEX(BECKMAN COULTER 中国有限公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1SD乳鼠CFs的提取与培养 取1～3 d的雄性SD乳鼠用75%酒精浸泡消毒后于生物安全柜中取出心脏，PBS清洗后用剪刀将心脏剪碎成泥状，加入2 mL的胰酶稀释液(胰蛋白酶 ∶PBS缓冲液=1 ∶1)并在水浴锅中水浴消化6 min，静置1 min后缓慢吸取上清液，加入等量培养基终止胰酶消化，重复操作4次使组织消化完全后1 000 r·min-1离心7 min。离心完弃上清向管中加入1 mL培养基，轻柔吹打，移到培养瓶中，在培养箱中培养1.5 h后，换液后贴壁的细胞即为CFs。显微镜下通过细胞形态学鉴定CFs，于细胞原代培养箱中培养传代，至2～3代可用于实验。显微镜下观察，免疫组化纤维黏连蛋白染色为阳性者即为CFs。

1.2.2实验分组 实验组：心肌成纤维细胞瞬时转染sDNMT1组；空白对照组(Vehicle)：不做任何处理组；阴性对照组(Negative Control)：心肌成纤维细胞瞬时转染对基因无影响的空载RNA。

1.2.3细胞转染 培养CFs在指数生长期进行转染，消化细胞后计数，等量接种于6孔板，待细胞生长到肉眼观60%至70%密度左右进行转染。实验组siDNMT 1的引物序列：5′-GCUGAGAUGGCGU CAUATTUAUGACGCCAUCUCUCAGCTT-3′；NC组的引物序列：sense：5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUT T-3′；antisense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。依据LipofectamineTM2000 Reagent 和siDNMT1的说明书对各组CFs进行细胞转染实验，培养4～6 h后给细胞更换含血清培养基培养，于24～48 h进行细胞总RNA的提取。

1.2.4提取总RNA及逆转录 TRIzol法提取各个分组细胞的总RNA。使用分光光度仪检测RNA的纯度和浓度后逆转录为cDNA。逆转录反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 15 min，所得cDNA放置-20 ℃保存。

1.2.5qPCR检测各转染组DNMT1、Col1A1、α-SMA的表达 取cDNA用 Bio-Rad CFX Maestro1.0 Real-Time系统进行反应扩增。设置反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，共进行40个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s作为熔解曲线阶段。β-actin作为内参。mRNA 的相对表达量应用2-ΔΔCT法计算。相关引物序列见Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6Western blot法检测CFs中DNMT1、Col1A1、α-SMA蛋白的表达 转染后的细胞继续培养48 h，提取各分组的总蛋白，测定每组蛋白的蛋白浓度，根据上清样量加入上样缓冲液100 ℃煮10 min后-20 ℃冰箱保存。SDS-PAGE蛋白电泳，根据分子量大小转膜对应时间，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，洗膜3次后孵育DNMT1、α-SMA、β-actin、Col1A1的一抗，4 ℃孵育过夜。一抗孵育完毕后洗膜3次后，二抗常温孵育1 h，洗膜3次后显影。结果使用ImageJ软件分析并分别计算DNMT1、Col1A1、α-SMA的蛋白表达水平。

1.2.7CCK-8法检测CFs瞬时转染后的增殖情况 分组：空白组、阴性对照组、siDNMT1组，每组设5个复孔。用胰酶消化处于对数生长期的各组细胞，加入培养基终止消化后进行细胞计数。计数后铺板于96孔板中，每孔体积200 μL，细胞密度为1.5×107·L-1，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。连续培养48 h后每孔滴加10 μL CCK-8试剂后放回培养箱孵育，3 h后检测吸光度。实验重复3次。

1.2.8细胞周期实验检测转染后CFs的细胞周期分布情况 分组：空白组、阴性对照组、siDNMT1组。转染24 h后，用胰蛋白酶消化下细胞后用冷PBS洗涤2次，后在4 ℃下用75%乙醇中固定过夜。随后，再用冷PBS洗涤细胞2次，用碘化丙锭(PI)和RNA酶混合染色液在4 ℃下避光孵育30 min后上流式细胞仪进行检测。所有实验结果通过Flowjo进行数据分析。实验重复至少3次。

2 结果

2.1 瞬时转染siDNMT1对DNMT1表达的影响如Fig 1所示，CFs瞬时转染siDNMT1、阴性对照组及空白组后培养48 h，瞬时转染siDNMT1的CFs中DNMT1表达较空白对照组和阴性组降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

Fig 1 qPCR analysis of DNMT1 expression after transient transfection of siDNMT1 in CFs for 48 **P<0.01 vs NC.

2.2 瞬时转染siDNMT1对CFs细胞增殖的影响Fig 2结果显示，CFs瞬时转染siDNMT1的CFs培养48 h后，细胞活力相比于空白对照组和阴性组明显下降(P<0.05)。

Fig 2 Percentages of CFs viability after 48 h of transient transfection of siDNMT1 compared with *P<0.05 vs NC.

2.3 瞬时转染siDNMT1对Col1A1、α-SMA mRNA表达的影响如Fig 3所示，CFs 瞬时转染siDNMT1培养24～48 h后，α-SMA、Col1A1 mRNA的表达相比于空白对照组和阴性对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05) 。

Fig 3 Changes of α-SMA and Col1A1 mRNA after transient transfection of siDNMT1 in CFs by *P<0.05 vs NC.

2.4 瞬时转染siDNMT1对CFs中DNMT1、α-SMA、Col1A1蛋白表达的影响如Fig 4所示，CFs瞬时转染siDNMT1 48 h后，DNMT1、Col1A1和α-SMA蛋白的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

Fig 4 Western blot analysis and relative protein expression of DNMT1,Col1A1 and α-SMA expression in CFs after transient transfection of siDNMT1 β-actin expression was measured as a A:Vehicle;B:NC;C:siDNMT1；*P<0.05 vs NC.

2.5 瞬时转染siDNMT1对CFs中细胞周期变化的影响如Fig 5所示，CFs瞬时转染siDNMT1 48 h后，G0/G1期的细胞比例较空白对照组和阴性对照组相比明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

Fig 5 Effect of siDNMT1 on cell cycle experiment of CFs determined by flow cytometry Representative images of three independent experiments are A:Vehicle;B:NC;C:siDNMT1;*P<0.05 vs NC.

3 讨论

心肌组织中有大量的心肌成纤维细胞，CFs的合成、分泌与心肌细胞外基质密切相关。在心肌纤维化的发生、发展中伴有CFs部分表型的异常改变和增殖，当心肌纤维化发生时，CFs出现异常增殖，转化成肌成纤维母细胞后分泌大量细胞外基质(ECM)并沉积，例如Col1A1、α-SMA等[9]。因此，CFs增殖后产生的大量胶原和ECM沉积是心肌纤维化发生与发展的关键因素[10]。研究表明，DNA甲基化转移酶与CFs增殖的调控密切相关，参与心肌纤维化的发生与发展[11-12]。在哺乳动物的DNA中，甲基化的的过程实质上是酶的反应过程。DNA甲基转移酶将甲基与CpG位点的胞嘧啶核苷酸结合(胞嘧啶直接跟随5'至3'的鸟嘌呤形成5-甲基胞嘧啶)[13]。其中DNMT1在CFs中的报道较少，在心肌纤维化中有其作用机制尚不明确但在肝纤维化中报道较多[14]。本课题通过在CFs中瞬时转染DNMT1 siRNA后与正常对照组和阴性对照组比较，在瞬时转siDNMT1的CFs中，DNMT1的表达明显下降，同时α-SMA和Col1A1的表达水平明显下降。在CFs中瞬时转染siDNMT1 48 h后，同空白组以及阴性对照组比较，CFs的活力明显下降。在CFs中瞬时转染siDNMT1 24～48 h后，同空白组以及阴性对照组比较，细胞G0和G1期的被阻滞明显。

综上所述，在CFs中转染siDNMT1后DNMT1表达明显下降，而CFs的增殖又可被DNMT1的低表达所抑制，表明DNMT1是影响CFs 增殖的关键因素。上述研究表明，DNMT1可能通过靶向调控下游基因的表达，进一步促进心肌纤维化，为探究DNMT1的具体作用机制提供了基础，也为心肌纤维机制的研究提供新的思路，但本研究尚处于初级探究阶段，仍需后期进行更深入研究。