组蛋白去乙酰化酶9对肾小球发育的调控

李 知 侯 庆 汪 玲 朱小东 翟修文 秦卫松 曾彩虹 陈朝红 刘志红

肾小球是肾脏的功能单位，肾小球滤过屏障是肾脏血液滤过装置，发育缺陷引起肾功能异常[1]。肾小球滤过屏障由肾小球血管内皮细胞、肾小球脏层上皮细胞即足细胞和基底膜构成[2]，其中，足细胞间的裂孔隔膜是肾小球滤过屏障的独特结构，裂孔隔膜发育障碍会导致蛋白尿的产生[3]。

哺乳动物的肾脏发育经历前肾、中肾和后肾三个阶段，前肾和中肾是哺乳动物胚胎时期的暂时器官，后肾是体内永久性器官[4]。斑马鱼肾脏发育经历前肾和中肾两个阶段，其在结构、功能和分子组成上均与哺乳动物肾脏相似和高度保守[5]。斑马鱼前肾在受精后(hours post-fertilization,hpf)80h即发育成熟，具有正常的肾小球滤过功能[6]；斑马鱼肾小球滤过膜与哺乳动物相同，由足细胞、肾小球血管内皮细胞和基底膜构成[7]。

在斑马鱼前肾发育过程中，肾脏祖细胞原肠期和体节发生期可通过不同转录因子的表达来区分，如pax2a，lhx1a和wt1a；在15体节期，足细胞的祖细胞被wt1b特异性标记，同时还表达pax2a和lhx1a；到24hpf，足细胞开始表达裂孔隔膜分子podocin和nephrin；在48～50 hpf，随着足细胞的发育和血管生成，肾小球开始形成，直至84hpf肾小球发育成熟[8-10]。因此，斑马鱼是研究肾脏发育的理想模型，被广泛应用[11-12]。

本研究前期发现组蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9，hdac9)在发育的肾小球中高丰度表达，随着肾小球发育完成其表达消失。本文拟通过基因编辑技术敲除hdac9基因，探究hdac9基因缺失对肾脏发育的影响。

材料与方法

斑马鱼饲养和繁殖野生型斑马鱼(AB品系)购买于国家斑马鱼资源中心。斑马鱼成鱼饲养于28.5℃恒温水中，照明14h/黑暗10h交替。斑马鱼胚胎饲养于28.5℃恒温培养箱中，每日更换养鱼水。实验过程中对动物的处置符合东部战区总医院动物伦理学标准。

主要试剂T7 High Yield RNA Transcription Kit(诺唯赞)，重组核酸酶Cas9蛋白(近岸)，2×SuperMix Taq(全式金)，pEASY-T5-Zero Cloning kit (全式金)，DNA Clean & Concentration (ZYMO Research)，RNA Clean & Concentration (ZYMO Research)，mMESSAGE mMACHINE T7 kit(Invitrogen)，MEGAclear Kit(Invitrogen)，Dig RNA Labeling Mix(Roche)，NBT/BCIP stock solution(Roche)。

斑马鱼突变体构建针对斑马鱼hdac9(Transcript ID:ENSDART00000079159)设计single-guide RNA (sgRNA)靶点(http://www.rgenome.net/cas-designer/)，反应体系：oligo F (10 μm) 5 μl，oligo R (10 μm)5 μl,2×SuperMix 10 μl；反应条件：94℃ 5 mins,50℃ 10 mins,72℃ 10 mins。DNA纯化回收PCR产物后，利用T7 High Yield RNA Transcription Kit 转录，纯化回收sgRNA。50 ng/μl sgRNA 和300 ng/μl重组Cas9蛋白37℃孵育10 mins，用于斑马鱼胚胎(AB品系)单细胞显微注射。所用引物见表1。

全胚胎原位杂交(WISH)斑马鱼hdac9,nphs1,nphs2,lhx1a,pax2a,mafba和wt1b探针模板通过PCR扩增后，克隆入pEASY-T5-Zero cloning 载体，地高辛标记的反义链RNA探针通过T7 High Yield RNA Transcription Ki t转录，60℃碱水解回收后使用。斑马鱼胚胎固定于4%多聚甲醛4℃过夜，标准操作如前所描述[13]。所用引物见表1。

表1 引物列表

信使RNA(messengerRNA，mRNA)合成斑马鱼hdac9全长编码序列通过PCR扩增克隆入pEASY-T5-Zero cloning 载体，正义链通过mMESSAGE mMACHINE T7 kit 体外转录成mRNA，MEGAclear Kit回收转录产物。75 ng/μl hdac9 mRNA 用于斑马鱼胚胎单细胞显微注射。

电镜斑马鱼胚胎固定于3.75%戊二醛，4℃过夜，乙醇、丙酮脱水，丙酮、树脂置换和浸透，包埋，烤制，切片，透射电子显微镜下观察拍照。

结 果

斑马鱼肾脏发育阶段hdac9的表达情况为了检测斑马鱼hdac9在肾脏发育阶段的表达分布情况，通过WISH检测发现hdac9在24hpf即开始在神经系统和发育中的前肾小球表达，持续表达至72 hpf (图1)。

图1 WISH检测hdac9在肾脏发育阶段的表达分布红色箭头为前肾小球；hdac9:组蛋白去乙酰化酶9；hpf:受精后小时

CRISPR/Cas9构建hdac9基因敲除斑马鱼为了探究hdac9基因在肾小球发育的作用，我们构建了hdac9基因敲除斑马鱼，针对斑马鱼hdac9基因第一号外显子区域设计了sgRNA，将sgRNA/Cas9蛋白复合体显微注射到AB品系野生胚胎的单细胞中，注射24h后，通过PCR验证敲除效率后，逐代筛选；通过PCR基因分型检测并测序确认hdac9纯合突变斑马鱼存在7个碱基缺失(图2A)；并通过WISH验证hdac9纯合突变的胚胎中hdac9的表达，如图2B所示，野生型幼鱼中可检测到hdac9在肾小球的表达，而hdac9基因敲除幼鱼中未见hdac9表达，表明hdac9基因敲除斑马鱼构建成功。

图2 hdac9基因敲除斑马鱼构建hdac9:组蛋白去乙酰化酶9；A：针对斑马鱼hdac9设计靶点(黑色下划线)，红色虚线为缺失碱基片段；B：WISH证实hdac9基因敲除鱼构建成功， 红色剪头所指为野生型幼鱼hdac9原位杂交信号

hdac9基因敲除导致前肾小球发育障碍通过亚甲蓝染色和透射电子显微镜成像观察hdac9敲除对肾小球超微结构的影响，结果显示hdac9缺失严重影响肾小球发育：与野生组相比，亚甲蓝染色显示hdac9敲除后肾小球区域仅有少许的细胞团，可见包曼氏囊轮廓，未见明显肾小球结构(图3A)；超微结构显示hdac9敲除斑马鱼肾小球滤过屏障发育障碍，足细胞数量显著减少，足细胞间裂孔隔膜消失(图3B)；WISH检测了足细胞裂孔隔膜的标志物podocin和nephrin的表达，与野生组相比，hdac9敲除导致podocin和nephrin的表达被明显抑制(图3C)。为了进一步证实hdac9敲除引起肾小球发育障碍和足细胞数量减少的表型特异性，我们在hdac9突变胚胎中回输了hdac9 mRNA；回输hdac9b mRNA后，肾小球滤过屏障、足细胞数量、podocin和nephrin的表达均被成功逆转。结果显示，hdac9缺失导致肾小球发育障碍。

图3 hdac9缺失对肾小球发育的影响A：肾小球亚甲蓝染色，黑色圆框虚线内为肾小球；B：肾小球超微结构，白色箭头所指为肾小球滤过屏障；C：足细胞标志物podocin和nephrin WISH结果(红色箭头所指为原位杂交信号)，120hpf：受精后120小时；dac9:组蛋白去乙酰化酶9

hdac9敲除对肾脏祖细胞表达的影响图1证实 hdac9在肾脏发育早期即开始表达，而hdac9基因敲除影响肾小球的正常发育和形成。因此，我们推测hdac9敲除在肾脏发育早期可能影响肾脏祖细胞的表达。通过WISH检测斑马鱼肾脏祖细胞标志物lhx1a,pax2a,mafba和wt1b的表达情况，我们发现hdac9敲除显著抑制了肾脏祖细胞的表达，尤其是足细胞祖细胞标志物mafba和wt1b表达；而当回输hdac9 mRNA之后，可显著逆转足细胞祖细胞标志物的表达，包括mafba和wt1b。结果显示，hdac9是肾脏祖细胞向足细胞分化所必需的。

图4 hdac9缺失对肾脏祖细胞的影响hdac9:组蛋白去乙酰化酶9；hpf:受精后小时；WISH检测肾脏祖细胞lhx1a,pax2a,mafba和wt1b的表达，24hpf；红色箭头所指为原位杂交信号

讨 论

本研究首次报道斑马鱼hdac9在肾脏发育阶段的时空表达分布，并证实hdac9是肾小球正常发育所必需的基因，hdac9很可能是影响了肾脏祖细胞的增殖功能，及其向足细胞的分化功能。

hdac是一类进化上高度保守的酶，至今，哺乳动物的hdac家族已发现18个成员，依据它们与酵母中同源蛋白结构的保守型及相似性，将其分为四类[14]。hdac活性对于维持胚胎发育、基因表达和分化均至关重要[15]，包括肾脏发育[16-17]。

研究表明，在小鼠肾脏发育过程中，Ⅰ类(hdac1～3)和Ⅱ类(hdac4、 hdac7、hdac9)家族成员随着肾脏发育的成熟，表达逐渐下降。其中hdac1～3在小鼠肾脏发育过程中表达最丰富[17]。利用Ⅰ类、Ⅱ类hdac广谱抑制剂Scriptaid处理胚胎期小鼠肾脏12小时会阻止肾脏发生及输尿管芽分支的形成，并且抑制肾脏祖细胞增殖相关基因如Eya1，WT1，Pax2，HNF1，FoxD1，Wnt9b，Gdnf以及分化相关基因如Pax8，Fgf8，Wnt4，Lhx1等的表达。在基因敲除小鼠中，hdac1和hdac2存在功能代偿；当同时敲除hdac1和hdac2时，发现其通过维持β-catenin和p53的活性调控小鼠肾脏输尿管芽细胞增殖、存活以及发育[18]。然而，hdac9对肾脏发育的影响至今不明。

本研究发现，斑马鱼hdac9在肾脏发育阶段高丰度表达在肾小球中，利用基因编辑技术构建hdac9基因敲除斑马鱼，进一步证实hdac9缺失导致肾小球滤过屏障发育缺陷，足细胞发育障碍，裂孔隔膜消失。肾脏组织来源于中间中胚层[19]，在发育早期，中间中胚层表达肾脏祖细胞的标记基因如pax2a和lhx1a等。在24hpf阶段，斑马鱼hdac9的表达分布与肾脏祖细胞分布一致，在hdac9基因敲除斑马鱼中，肾脏祖细胞标志物的表达，包括lhx1a,pax2a,wt1b和mafba，均受到了抑制，并且回输hdac9 mRNA之后，显著逆转了肾脏祖细胞和足细胞标志物的表达，说明基因敲除hdac9会抑制肾脏祖细胞增殖相关基因wt1b喝mafba，分化相关基因pax2a和lhx1a的表达，此结果与既往结果吻合[17]。因此，在肾小球发育过程中，hdac9同时维持了肾脏祖细胞的增殖功能和分化功能，是肾脏祖细胞向足细胞分化所必需基因。

综上所述，我们首次发现hdac9在肾小球发育过程中扮演着重要的角色，并且利用斑马鱼模型和基因编辑技术证实，在肾脏发育过程中，hdac9是维持肾脏祖细胞向足细胞分化所必需的，而其具体的调控机制有待进一步探究。