脑胶质瘤患者组织中同源框基因10及小泛素相关修饰蛋白的表达及临床意义

李晓波，夏 鹰，聂 柳，金 虎

海口市人民医院 神经外科 (海口 570208)

目前，脑胶质瘤的临床治疗主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等方法[1-4]。同源框基因(homeobox gene，HOX)在结肠癌、胶质细胞瘤、骨肉瘤等恶性肿瘤组织中表达异常。结直肠癌细胞中HOXDl0基因表达上调，可抑制癌细胞活力，诱导癌细胞凋亡[5]。研究[6]表明，蛋白的小泛素样相关修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)化与去SUMO化为体内一种动态可逆的过程，SUMO化可能促进胶质瘤发生。小泛素相关修饰物特异性蛋白酶6(small ubiquitin related modifier-specific proteases 6，SENP6)通过特异性降解小泛素相关修饰物分子，参与机体恶性肿瘤疾病进程[7]。目前，关于脑胶质瘤中HOXD10及SENP6蛋白表达情况及机制的研究较少。因此，本研究期望通过检测脑胶质瘤患者脑组织中上述两种蛋白表达水平，分析其与患者临床病理参数及生存率的关系，为该疾病的临床诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2012年2月至2015年2月经海口市人民医院确诊并行手术治疗的脑胶质瘤患者40例为研究对象，设为试验组，其中男26例，女14例，年龄48～65(54.2±8.1)岁；临床分期：依照WHO关于脑胶质瘤的分类及分级标准[8]，Ⅰ期6例、Ⅱ期18例、Ⅲ期9例、Ⅳ期7例。纳入标准：1)符合脑胶质瘤诊断标准[9]并经过术后病理检查证实者；2)临床资料完整者；3)原发性脑胶质瘤者；4)初次治疗者，即术前未行生物治疗、化疗、放疗等。排除标准：1)合并心、肝、血液系统严重疾病者；2)临床资料缺失者；3)合并全身性感染疾病或神经系统病变者；4)合并其他恶性肿瘤者。选取同期本院颅脑损伤需行颅内减压手术治疗患者40例为对照组，男22例，女18例，年龄43～62(52.8±7.9)岁。入选本研究的患者均签署知情同意书，试验组患者均符合脑胶质瘤的相关诊断标准。本次临床研究已获得伦理委员会批准。入院时两组基本资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

利用蛋白质印迹技术(Western blot)检测两组患者组织中HOXD10、SENP6蛋白表达情况。步骤：两组患者脑组织于冰上破碎后，利用放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解，冰浴15 min，离心15 min(离心速度4 000 r/min，离心半径10 cm)，取上清液，上样于10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)分离蛋白，转膜后封闭1.5 h，分别加入鼠抗人一抗(HOXD10、SENP6及GAPDH)(购自上海安研商贸有限公司)，4 ℃孵育过夜。次日加入兔抗鼠二抗室温孵育1.5 h，胶片曝光照相。采用Image-Pro Plus图像分析管理系统分析，以特异性条带平均吸光度(A)值与面积的乘积为有效值，代表蛋白相对表达量。以GAPDH为内标参照物。

1.3 蛋白表达水平与病理特征关系分析

分析HOXD10、SENP6蛋白阳性表达与脑胶质瘤患者临床病理特征的关系，包括患者的年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、分化程度及有无淋巴结转移。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组HOXD10、SENP6蛋白表达比较

试验组HOXD10蛋白相对表达量为(0.39±0.05)，明显低于对照组(1.07±0.12)；试验组SENP6蛋白相对表达量为(1.25±0.13)，明显高于对照组(0.26±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)(表1、图1)。

表1 两组HOXD10、SENP6蛋白表达比较

2.2 两种蛋白与临床病理特征关系分析

本研究以HOXD10、SENP6蛋白相对表达量的均值为标准，高于均值即为高表达，低于均值即为低表达。结果显示，肿瘤大小≥3.0 cm、临床分期为Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴结转移的脑胶质瘤患者组织中HOXD10蛋白高表达率低于肿瘤大小<3.0 cm、临床分期为I期、Ⅱ期和无淋巴结转移的脑胶质瘤患者，而肿瘤大小≥3.0 cm、临床分期为Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴结转移的脑胶质瘤患者组织中SENP6蛋白高表达率高于肿瘤大小<3.0 cm、临床分期为I期、Ⅱ期和无淋巴结转移的脑胶质瘤患者(表2)。

表2 两种蛋白水平与临床病理特征关系[n(%)]

2.3 患者生存率分析比较

随访36个月，HOXD10高表达组患者生存率为61.11%，HOXD10低表达组患者生存率为27.27%，与HOXD10高表达组比较，差异有统计学意义(2=4.245，P=0.039)；SENP6高表达组患者生存率为23.81%，SENP6低表达组患者生存率为57.90%。与SEMP6高表达组比较，差异有统计学意义(2=5.174，P=0.023)(图2～3)。

3 讨论

脑胶质瘤的致癌因素主要为先天遗传高危因素和环境因素。脑胶质瘤具有发病率高、复发率高及患者预后差等特点，给临床治疗带来了极大的挑战[10-11]。既往研究[12]表明，脑胶质瘤占中枢神经系统恶性肿瘤的81%。本研究观察了HOXD10、SENP6蛋白在两组患者组织中的表达水平，结果显示，试验组患者肿瘤组织中HOXD10蛋白相对表达量明显低于对照组；SENP6蛋白相对表达量明显高于对照组患者(P<0.05)。结果表明，HOXD10蛋白在脑胶质瘤患者组织中低表达，而SENP6蛋白呈高表达，初步推断两者表达水平与脑胶质瘤疾病的发生有密切关系。

本研究进一步分析了两种蛋白表达水平与临床病理参数之间的关系。结果显示，HOXD10、SENP6蛋白表达与肿瘤大小、临床分期及有无淋巴结转移密切相关(P<0.05)，结果表明肿瘤大小≥3.0 cm、临床分期为Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴结转移的脑胶质瘤患者组织中HOXD10蛋白高表达率低于肿瘤大小<3.0 cm、临床分期为I期、Ⅱ期和无淋巴结转移的脑胶质瘤患者，而肿瘤大小≥3.0 cm、临床分期为Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴结转移的脑胶质瘤患者组织中SENP6蛋白高表达率高于肿瘤大小<3.0 cm、临床分期为I期、Ⅱ期和无淋巴结转移的脑胶质瘤患者。已有研究[13]显示，HOXD10蛋白的阳性表达水平与胶质瘤细胞的增殖、侵袭及迁移等过程均密切相关。HOXD10在肿瘤细胞中发挥抑癌基因作用，且其可以通过下调Ras同源家族基因C(ras homolog gene family member C，RhoC)的表达，抑制RhoC蛋白在组织中的表达水平，进而降低胶质瘤细胞的侵袭与转移能力[14]。SENPs蛋白的表达水平与乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌等多种疾病的发生发展有关，可通过提高核因子κB(NF-κB)活化水平，激活NF-κB通路，加速正常细胞凋亡[6]。研究[7]表明，SENP6蛋白可特异性降解蛋白小泛素相关修饰物分子，提高泛素化降解水平，增加外界刺激对NF-κB信号通路的激活作用，导致NF-κB通路被激活，使正常细胞受到损伤。因此推断，HOXD10、SENP6蛋白表达水平与脑胶质瘤患者临床病理的关系可能与上述机制有关。

已有研究[15]表明，HOXD10低表达可作为原发性肝细胞癌治疗和生存率预测的参考指标。生存分析结果显示，HOXD10高表达组患者3年生存率明显高于HOXD10低表达组；SENP6高表达组患者3年生存率明显低于SENP6低表达组(P<0.05)。HOXD10蛋白及SENP6蛋白均为脑胶质瘤患者的生存率预测因子，检测上述蛋白有助于对脑胶质瘤病情的判断及生存率评估。

综上所述， HOXD10蛋白在脑胶质瘤患者组织中低表达，SENP6蛋白呈高表达；其阳性表达水平与肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移有关。HOXD10、SENP6蛋白表达程度与脑胶质瘤疾病患者生存率有密切的关系，在脑胶质瘤疾病进程中有重要作用，可作为该疾病临床诊断的重要标志物。此外，两种蛋白之间是否存在负相关关系，有待进一步研究。