紫杉醇单独或与甲氨蝶呤联合用药对关节炎的治疗作用及其机制*

盛正和，曾 健，黄 文，李 玲，李斌斌，吕 超，颜凡棋

1.柳州市人民医院 中医科(柳州 545006)；2.广西中医药大学 研究生院(南宁 530001)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种病因未明的以炎性滑膜炎为主的系统性慢性疾病，基本病理改变是滑膜炎、晚期关节畸形和功能障碍，严重影响患者生活质量[1]。甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)是临床治疗RA应用广泛的抗风湿药物之一，已成为RA 联合用药方案的基础药物[2]。但MTX单独使用时，疗程较长，容易导致副作用增加，部分患者不能耐受[3]。紫杉醇(paclitaxel, PTX)作为从红豆杉树皮中提取的一种双萜类伪生物碱，能影响机体一系列重要细胞免疫和炎症活动[1]。研究[4]发现，PTX 可以缓解胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠关节肿胀程度，改善RA症状。PTX和MTX作为关节炎治疗的潜在有效药物，二者联合用药对RA治疗效果及作用机制还不清楚，故本实验采用胶原诱发建立大鼠CIA模型，给予 MTX和PTX不同剂量单独或联合给药观察疗效，对MTX、PTX对RA的作用机制进行深入研究，旨在为临床治疗RA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要药物及试剂 PTX(阿拉丁试剂，P106868-10 mg)；MTX(阿拉丁试剂，M111239-500 mg)、Ⅱ型胶原蛋白、弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)；大鼠IL-1β、IL-6、IL-12、TNFα ELISA试剂盒(武汉博士德工程有限公司)；MMP-3 ELISA试剂盒(北京诚林生物科技公司)；ECL发光试剂盒、β-Actin 抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗免IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司)；TLR4、p-NFκBp65抗体(英国Abcam公司)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)。

1.1.2 主要仪器 BX51T-PHD-J11型显微镜(日本奥林巴斯公司)；RM2015型切片机(德国莱卡公司)；计算机图像处理系统CMOS(日本奥林巴斯公司)；CA91786 U.S.A UVP GDS-8000 UVP凝胶成像系统(美国Thermo公司)；DYCZ-24DN型电泳仪系统(北京六一公司)；WSE-4040型半干转膜仪系统(美国ATTO公司)；SPECTRONIC®GENESYSTM型紫外可见分光光度计(美国 Milton roy公司)；TS-8型转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司)；ELX800型酶标仪(美国BIO-TEK公司)。

1.1.3 Ⅱ型胶原免疫乳剂制备 将Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的冰醋酸中，制成2 g/L的Ⅱ型胶原溶液，然后与等体积的弗氏完全佐剂混匀制备成乳剂，乳剂中Ⅱ型胶原的浓度为1 g/L。

1.1.4 大鼠CIA模型建立 SPF级雌性SD 大鼠，体重120～150 g，购自于上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2017-0005]。在大鼠背部中轴线选择3个接种位点，每个接种位点接种100 μL免疫乳剂。同时在大鼠尾根部注射200 μL乳剂。7 d后在相同的接种点接种同样剂量乳剂增强免疫。14 d后四肢红肿为CIA模型构建成功。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠CIA模型建立及分组 将建模成功的CIA SD大鼠随机分为6组，每组10只。空白组与CIA模型对照组常规饲养；MTX治疗组腹腔MTX给药，给药剂量为1 mg/kg，1次/周；PTX低、中、高剂量组进行腹腔PTX给药，给药剂量分别为1.5、2.5、3.5 mg/kg，隔日给药1次；MTX+PTX联合治疗组腹腔MTX给药，给药剂量为1 mg/kg，1次/周，同时进行腹腔PTX给药，给药剂量为3.5 mg/kg，隔日给药1次。以上每组连续给药4周后，结束给药治疗。

1.2.2 踝关节炎症病理学观察 断颈处理大鼠，收集右后肢完整踝关节，4%多聚甲醛固定过夜，常规石蜡包埋，4 μm切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素染色，流动水冲洗后，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光镜下观察关节滑膜有无增生、血管数量是否正常、滑膜组织有无炎性细胞浸润、组织是否有水肿及充血等现象。

1.2.3 免疫组织化学检测 将新鲜取材的组织块用4%多聚甲醛溶液固定，铜制模具包埋，4 μm切片，脱蜡入水，3%甲醇双氧水，室温20～30 min，采用高压修复，放入磷酸盐缓冲液(PBS)中，切片上滴加一抗羊抗鼠(1∶200)，4 ℃过夜，用PBS洗2～3次，切片上滴加生物素化二抗，37 ℃下放置20 min，用PBS洗2～3次，再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB 显色，脱水、透明中性树胶封片，在每个载玻片中选取阳性表达强的5个视野，并通过Image-Pro Plus软件计算IL-6和IL-1β阳性细胞比例。

1.2.4 蛋白质印迹技术(Western blot)检测 选取症状明显的左后肢关节滑膜组织，加入裂解液，收集上清液并使用BCA蛋白质定量试剂盒测量蛋白质浓度。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂乳封闭膜1 h，加入一抗(TLR4, 1∶200; p-NFκBp65, 1∶200)，4 ℃过夜。将孵育一抗的膜用PBST洗涤3次，将二抗用PBST稀释3 000倍，与膜室温孵育90 min，用PBST洗去游离二抗，使用ECL试剂盒进行检测，以β-Actin为内部对照，用UVP分析仪进行扫描以确定TLR4和p-NFκBp65蛋白的相对表达。

1.2.5 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测 对各组大鼠进行尾静脉取血，采血后室温静置1 h，4 ℃，离心速度1 500 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，取上清液，根据ELISA试剂盒的说明书测定血清中MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα的含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 6组大鼠踝关节IL-6和IL-1β的表达比较

免疫组化检测结果，IL-6和IL-1β阳性表达于细胞浆内，呈棕色或棕黄色。CIA模型组阳性细胞数量明显高于空白组(P<0.05)。与模型组相比， MTX组、PTX低剂量组、PTX中剂量组、PTX高剂量组以及MTX+PTX联合治疗组的细胞阳性细胞数量均有不同程度降低，阳性信号强度减弱，其中以PTX高剂量组降低明显(P<0.05)(图1～2)。

2.2 6组大鼠踝关节炎症病理形态比较

HE染色结果显示，与空白组相比，CIA模型组滑膜出现大量炎性细胞，组织水肿，结构紊乱且滑膜不完整，组织内血管数量增多，血管扩张且部分血管有充血等现象。与模型组相比，各治疗组对以上组织病理学损伤均有不同程度的改善，其中以PTX高剂量组改善效果较为明显。PTX高剂量组偶见炎性细胞浸润，无水肿及充血现象，血管数量达到正常组水平，滑膜结构整体较完整(图3)。

2.3 6组大鼠滑膜组织中TLR4和p-NFκBp65蛋白表达

CIA模型组中TLR4和p-NFκBp65蛋白表达水平明显高于空白组(P<0.01)。与模型组相比，各治疗组TLR4和p-NFκBp65的表达量均有所下降，PTX高剂量组降低尤为明显(P<0.01)(图4)。

2.4 6组大鼠血清中MMP-3、IL-12、IL-6、IL1-β和TNFα含量比较

模型组中MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β、TNFα的含量明显高于空白组(P<0.01)。与模型组相比，各治疗组中MMP-3、IL-12、IL-6、IL1-β、TNFα的含量均有不同程度的降低(P<0.05)，且PTX高剂量组降低更明显(图5)。

3 讨论

RA 是一种常见的以关节滑膜炎为特征的慢性、全身性、自身免疫性疾病，是一种多因素疾病[5]。RA发病可能与溶血性链球菌或其他细菌代谢产物、病毒等的持续感染所引起的遗传易感个体的自身免疫反应密切相关[6]。RA的治疗药物主要是非甾体抗炎药、抗风湿药、糖皮质激素和植物药等，这些药物能缓解病情却毒副作用较大。故寻找到一种安全有效、副作用少的治疗药物或方案已成为临床研究的重点。CIA与人类RA具有多种相似的免疫及病理特征，是目前理想的关节炎模型，故CIA已成为研究RA发病机制和治疗药物筛选的理想模型[7-8]。本研究通过构建CIA大鼠模型，探讨MTX和PTX不同剂量单独或联合给药对CIA大鼠的治疗作用比较及机制，为用于治疗RA找到PTX优选剂量以及联合给药的可能性提供依据。

以往研究[5-8]结果提示，PTX与MTX对RA具有治疗作用，但对于PTX单独使用剂量或与MTX联合用药对关节炎的药效尚不清楚。本研究结果显示，MTX和PTX均可改善RA病理特征，但MTX+PTX联合治疗组未能呈现最佳疗效，并且在实验中观察到MTX+PTX联合治疗组大鼠创口不愈合的情况，而PTX高剂量组显示出对CIA大鼠的最佳疗效。这一结果可能与MTX主要作用于细胞周期的S期，对G1/S期细胞也有延缓作用，同时PTX主要作用于细胞周期的G2/M期，两药联合时抑制炎症细胞增殖的同时过度干扰正常细胞有丝分裂，造成药源性组织损伤[9-10]。PTX与MTX联合用药效果低于PTX单独给药，且PTX 3.5 mg/kg隔日腹腔给药一次，为本研究观察到的优选剂量。PTX和MTX作为关节炎治疗的潜在有效药物，对RA的发生与发展具有重要作用[1，11]。Oliver等[12]发现PTX可降低关节炎评分，能抑制CIA大鼠关节炎的发展，Brahn等[13]发现在CIA发病前用PTX进行预防，可防止CIA发生，而CIA发病后用PTX治疗可减轻临床症状，包括红肿及发热消退。同时也有临床研究[14]表明，小剂量应用MTX可改善RA 患者的主要症状、体征，并可减少炎性渗出。

研究[15-16]表明，IL-12、IL-6、IL1-β具有提高血管通透性，促进滑膜组织血管新生的作用，可促进滑膜慢性炎症的形成。TNFα可促进滑膜细胞分泌炎性递质，刺激血管扩张渗出, 从而加强炎症反应[17]。MMP-3是参与关节炎的主要介质，可促进成纤维细胞生成，同时还参与胶质蛋白酶的激活，导致炎症的发生[18]。周玮等[19]研究发现，抑制 IL-1β 和TNFα表达可达到抗关节炎的作用，炎症因子在RA发展中具有重要作用，本研究检测了CIA大鼠血清中炎症因子的表达情况，结果表明，PTX与MTX可抑制血清中炎症因子MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα的表达。自身的免疫反应与RA发病机制密切相关[20-21]。本研究结果显示，PTX与MTX均可明显抑制TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表达。已有研究[22]发现，TLR4是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接特异性免疫和非特异性免疫的桥梁，NF-κB是RA滑膜炎症发生发展的一条重要细胞信号转导途径，其活化的失调与RA直接相关[23- 24]。TLR4启动的细胞内信号转导可以激活NF-κB，且NF-κB可通过调节炎性细胞因子的表达参与炎症反应的扩增[25]。NF-κB激活的主要表现为抑制IKBα的磷酸化并对此发生降解，然后进入细胞核中，诱导特定基因的表达，激活多种炎性细胞因子[25]。本研究结果显示，TLR4和p-NF-κBp65的表达与血清中炎症因子的表达呈正相关，推测当抑制TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表达可降低MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα含量。侯晓彬等[26]发现，p-NF-κBp65的结合部位常在促炎细胞因子和免疫调节介质的启动部位，因此p-NF-κBp65表达增高可触发促炎细胞因子IL-6、TNFα合成。以上研究结果说明，PTX与MTX可能通过抑制TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表达，从而对RA起治疗作用。

综上所述，PTX单独给药治疗作用优于PTX与MTX联合给药，且PTX 3.5 mg/kg隔日腹腔给药一次，是本研究观察到的优选剂量。PTX与MTX对RA具有治疗作用，其作用机制可能是PTX和MTX能够在一定程度上抑制CIA模型滑膜组织中TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表达，从而降低血清中炎症因子的含量。