猫白介素18 基因的克隆、表达及其产物的生物学活性分析

李 华，汉武娇，牛 超，潘荣辉，姜艳平，崔 文，李一经,2,，徐义刚,2,*

（1. 东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2. 黑龙江省动物疾病防控技术与制剂创制重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；3. 吉林省动物疫病预防控制中心，吉林 长春 130062）

随着我国宠物行业的兴起及其规模不断扩大，宠物猫饲养数量逐渐增加，猫瘟、猫获得性免疫缺陷病、猫白血病、猫传染性腹膜炎等病毒性传染病也随之呈现蔓延趋势，严重危害宠物猫的健康并制约着宠物业的发展[1]。疫苗接种是预防病毒性疾病的主要措施，然而目前市场上缺乏有关猫病毒性疾病的疫苗产品，以及有效的临床治疗制剂，只能根据患病猫不同临床症状而采取对应的治疗方案，不仅治疗费用昂贵，而且患病猫治愈率低。因此，研制能有效地治疗猫病毒性疾病的治疗制剂，对保障宠物猫的健康养殖具有重要意义。

白介素18（IL-18）属于IL-1 家族成员，主要由活化的巨噬细胞产生，具有良好的抗病毒感染作用，可诱导IFN-γ合成，调节促炎性细胞因子的生成[2-3]。同时，IL-18 能有效刺激T 细胞增殖，可直接激活CD8+T 细胞，增强自然杀伤细胞活性，在病毒的清除中起着重要作用[4-7]。因此，本研究基于IL-18 在抗病毒感染、介导炎症反应等方面具有的生物学作用及其潜在的应用价值，以猫IL-18 为研究对象，克隆猫IL-18 编码基因进行原核表达，并对其产物进行生物学活性分析，以期为猫IL-18 制剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及实验动物水泡性口炎病毒（VSV）、猫冠状病毒（FCoV）由本实验室保存；F81细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠；rTaq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、质粒pMD19-T simple 购自宝生物工程（大连）有限公司；TRIzol 购自上海飞捷生物技术有限公司；ReverTra Ace 高效逆转录酶购自东洋坊（上海）生物科技有限公司；3C蛋白酶、polyI:C 购自NEB 公司；DNA 胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）公司；His 标签蛋白Ni 柱亲和纯化柱购自北京全式金生物技术有限公司；F81 细胞、可溶性表达载体pCold-TF、大肠杆菌感受态TG1 和BL21 由本实验室保存；商用猫IFN 购自上海融棋贸易公司；健康狸花猫购自哈尔滨专业宠物市场；SPF级BALB/c小鼠购自辽宁长生实验动物中心。

1.2 引物设计根据GenBank 中登录的猫IL-18 基因序列（NM_001009213），利用Oligo 6.0 软件设计扩增猫IL-18 的PCR 引物：5'-GGTACCATGGCTGCTATACCAGTAGAT-3'（上游引物IL-18-F，含BamH I位点）和5'-GGATCCCTAATTCTTGTTTTGAACAGTGA-3'（下游引物IL-18-R，含Kpn I 位点），引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.3 重组质粒的构建及鉴定取2 mL 100 TCID50的VSV 病毒液，联合500 μL 浓度为1.0 mg/mL 的poly I:C 持续注射实验猫3 d，每天一次，于第10 d 迫杀实验猫，无菌分离实验猫脾脏。取0.2 g 脾脏组织，剪碎，加入适量DMEM 培养液，采用液氮研磨法将脾脏组织研磨成匀浆液，取300 μL 匀浆液，采用TRIzol 法提取总RNA，经ReverTra Ace 高效逆转录酶反转录后获得cDNA。以cDNA 为模板，PCR 扩增猫IL-18 基因，PCR 条件为：95 ℃5 min；94 ℃30 s、62 ℃30 s、72 ℃45 s，共35 个循环；72 ℃10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并采用DNA 胶回收试剂盒回收纯化目的基因。将纯化的PCR 产物与pMD19-T simple 连接，转化至大肠杆菌TG1 感受态细胞，经测序（吉林库美生物公司）筛选阳性克隆，阳性重组质粒命名为pMD-IL-18，并分析猫IL-18基因的同源性。将pMD-IL-18 和表达载体pCold-TF分别经BamH I 和Kpn I 双酶切，回收目的片段，经T4 DNA 连接酶连接后转化至大肠杆菌感受态细胞BL21 中，经培养后提取重组质粒，采用酶切和PCR方法鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pCold-IL-18，阳性重组菌命名为pCold-IL-18/BL21。

1.4 猫rIL-18 的诱导表达及纯化将过夜活化的重组菌pCold-IL-18/BL21 按1∶100 的比例接种于10 mL含Amp+抗性的LB 液体培养基，37 ℃振荡培养至OD600nm约 为0.5 时，加 入终浓度为0.4 mmol/L 的IPTG诱导6 h，离心收集菌体，超声破碎，以IPTG 诱导的空载体菌和未经诱导的重组菌为对照，利用12%SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达。通过His 标签蛋白Ni柱亲和纯化重组蛋白（rIL-18），经3C蛋白酶处理后再次通过Ni 柱亲和纯化rIL-18，经SDS-PAGE 分析纯化效果，将目的蛋白分装后于-80 ℃保存备用。

1.5 猫rIL-18 促脾淋巴细胞增殖活性的检测取BALB/c 小鼠和猫脾淋巴细胞，调整细胞浓度为105个/mL，分 别 加 入 浓 度 为5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL 的猫rIL-18 共培养60 h，同时设RPMI1640 培养液对照组和ConA 阳性对照组，采用MTT 法检测淋巴细胞的增殖情况。

1.6 猫rIL-18 联合临床用干扰素（IFN）的抗病毒效果评价采用微量细胞病变抑制法检测猫rIL-18 协同商用猫IFN 的抗病毒效果。将F81 细胞接种于96孔板于37 ℃、5%CO2培养至长满单层后，每孔加入100 μL 经DMEM（含终浓度为25 μg/mL 的猫rIL-18）10 倍倍比稀释的商用猫IFN，继续培养18 h。然后，分别接入MOI 1 的VSV、FCoV 病毒液，同时设立IFN 对照组、病毒对照组以及F81 细胞对照组。当病毒对照组出现约80%的细胞病变时，弃去培养液，加入染色液（20%乙醇+0.05%结晶紫水溶液）室温作用30 min，然后加入脱色液（50%乙醇+0.1%乙酸溶液）室温作用5 min 后，测OD540nm值。

2 结 果

2.1 重组质粒的构建及鉴定结果采用VSV 结合poly I:C 方法刺激实验猫，分离猫脾脏，采用TRIzol法提取总RNA，经反转录后获得cDNA，以其为模板，PCR 扩增猫IL-18 基因，结果显示，获得大小为579 bp的目的基因（图1），测序后与GenBank中登录的猫IL-18序列进行比较，同源性最高为99.3%。将目的基因克隆至原核可溶性表达载体pCold-TF并转化大肠杆菌感受态BL21，重组菌经培养后提取重组质粒经BamH I 和Kpn I 双酶切鉴定，结果显示，获得与预期大小相符的目的条带（图2），表明正确构建了重组质粒pCold-IL-18，将重组菌命名为pCold-IL-18/BL21。

图1 猫IL-18 基因的RT-PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of gene encoding feline IL-18 by RT-PCR

图2 重组质粒pCold-IL-18 的双酶切鉴定结果Fig.2 Digestion analysis of pCold-IL-18

2.2 猫rIL-18 的诱导表达及纯化结果重组菌pCold-IL-18/BL21 经IPTG 诱导，超声裂解菌体后经SDS-PAGE 检测，结果显示，在约70 ku 处表达出目的蛋白（图3A）。采用His 标签蛋白Ni 柱亲和纯化重组蛋白，将纯化的重组蛋白进一步经3C 蛋白酶处理后，再次利用His 标签蛋白Ni 柱亲和纯化，获得目的蛋白猫rIL-18（图3B）。

图3 rIL-18 蛋白诱导表达及纯化的SDS-PAGE 结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of rIL-18 protein induction and purification

2.3 猫rIL-18 促脾淋巴细胞增殖活性检测结果分离BALB/c 鼠和猫脾淋巴细胞，经细胞计数后，分别经不同浓度的rIL-18 刺激，采用MTT 法检测淋巴细胞的增殖情况。结果显示，猫rIL-18 能够促进BALB/c 小鼠和猫脾淋巴细胞增殖，当浓度为50 μg/mL 时促淋巴细胞增殖活性最强（图4），表明可溶性表达的猫rIL-18 具有促进脾淋巴细胞增殖活性。

图4 猫rIL-18 促脾淋巴细胞增殖活性的检测结果Fig.4 The effect of feline rIL-18 on spleen lymphocyte proliferation

2.4 猫rIL-18 协同猫IFN 抗病毒效果检测结果以VSV 和FCoV 为模式病毒，采用微量细胞病变抑制方法评价猫rIL-18 协同猫IFN 的抗病毒效果。结果显示，猫rIL-18 联合IFN 时对VSV、FCoV 的抗病毒效果明显优于IFN 单用组（p＜0.01）（表1）。表明猫rIL-18 联合IFN 可显著增强抗病毒效果。

表1 猫rIL-18 联合IFN 抗病毒效果检测结果Table 1 Antiviral effect of feline rIL-18 combined with interferon

3 讨 论

IL-18 由活化的巨噬细胞和多种免疫细胞产生，具有多种生物学活性，主要表现在：刺激IFN-γ产生，增强炎性细胞因子分泌，进而调节宿主的防御功能；激活NK 细胞，对感染细胞产生细胞毒性，从而增强机体抗感染能力[8]；与IL-12 联合刺激T 细胞的增殖分化，诱导Th1/Th2 型细胞反应[9]；激活B 细胞，介导细胞免疫反应[10]。因此，IL-18 在抗感染、介导炎症反应等方面具有潜在的应用前景和研发价值[11-14]。本研究根据目前宠物猫饲养数量日益增多而猫病毒性疾病治疗制剂不足的现状，开展猫IL-18 的基因克隆、表达及其生物活性研究。采用病毒联合polyI:C 方法刺激实验猫，克隆了猫IL-18编码基因，经序列比对与已知猫IL-18 基因的同源性最高为99.3%。

已有研究显示，利用原核表达系统以包涵体形式表达的猫IL-18 表达量低且没有生物学活性[15]。因此，本实验采用了原核可溶性表达系统pCold-TF进行猫rIL-18 的制备。pCold-TF 载体表达宿主菌广，提供冷休克诱导的方法可高水平表达目的蛋白，而其它杂蛋白的产量相对较少，同时对表达的目的蛋白可进行修饰和折叠进而分泌到细胞质中，而不以包涵体形式存在，超声裂解菌体即可获得目的蛋白，为蛋白的获取以及纯化提供了极大方便。更为重要的是，pCold-TF 载体中带有的可溶性标签“触发因子（Trigger factor，TF）”可以有效地提高蛋白质的正确折叠效率，使被表达的目的蛋白具有更高的生物活性。本研究构建的重组大肠杆菌pCold-IL-18/BL21 经IPTG 诱导能够高效可溶性表达rIL-18，经His 标签蛋白Ni 柱纯化后的蛋白浓度达220 mg/L，蛋白产量可观，为进一步的开发利用奠定了良好基础。更有意义的是，制备的猫rIL-18 具有促淋巴细胞增殖生物活性，在体外能够有效地刺激脾淋巴细胞增殖，且当浓度为50 μg/mL 时促脾淋巴细胞的增殖活性最高。以上研究结果表明，与以包涵体形式表达目的蛋白的原核表达系统相比，原核可溶性表达系统pCold-TF 优势较为明显，利用原核可溶性表达系统制备猫rIL-18 不仅蛋白产量高，而且表达的rIL-18 具有良好的生物活性。

IL-18 是诱导T 细胞、B 细胞、NK 细胞反应的强有力佐剂，而且IL-18 无免疫原性，不会引起自身免疫疾病。此外，IFN 具有较强的免疫调节功能，是一种非特异性广谱抗病毒生物制剂，利用IFN 治疗病毒性疾病可显著提高患病动物的治愈率，在临床上被视为抗病毒感染的首选治疗性药物，也是目前治疗猫病毒性疾病主要的生物制剂。本研究初步评价了猫rIL-18联合临床用猫IFN的抗病毒效果，两者联合后可显著提高抗病毒效果，其中抗VSV 活性提高了约8 倍，抗FCoV 活性提高了约12倍，本研究结果为猫rIL-18 和猫IFN 在临床上联合用于治疗猫病毒性疾病提供了依据。

综上，本研究克隆了猫IL-18 基因，构建了原核可溶性表达猫IL-18 的重组大肠杆菌pCold-IL-18/BL21，经IPTG 诱导高效表达了rIL-18，研究结果显示猫rIL-18 具有良好的促脾淋巴细胞增殖活性和抗病毒活性，为进一步对其开发利用奠定了基础。