2016 年～2018 年华东地区家禽沙门菌的分离鉴定及耐药性分析

仲 艳，王希玉，李海宾，冯 政，胡建乐，费中杰，杨 铜，钱 程，张凯云，刘岳龙，秦 涛，陈素娟*，彭大新*

（1. 扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225000；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3. 江苏立华牧业股份有限公司，江苏 常州 213100）

沙门菌（Salmonella）是一种非常重要的人兽共患病原菌，血清型众多，目前已报道的血清型约有2600 种，中国至少有292 种。禽类感染沙门菌主要引起鸡白痢、禽伤寒和副伤寒，主要侵害幼龄和青年动物，多表现为肠炎和败血症；禽沙门菌病不仅可以水平传播，还能垂直传播[1]，可导致禽群生产性能降低，影响雏禽的存活率，给养禽业带来重大损失。目前，沙门菌被认为是世界范围内重要的食源性致病菌[2]，食物传播是人类感染沙门菌的主要途径，畜禽及其肉制品和蛋是沙门菌等食源性病原菌的重要传播基质[3]。我国对禽沙门菌病非常重视，将其列为16 种优先防治的动物疫病之一[4]。因此，禽沙门菌病的防治已成为养殖业亟待解决的重要问题之一。

目前在家禽养殖生产中，抗生素的滥用导致细菌耐药现象严重[5]，许多病原菌在选择压力下出现了多重耐药[6]，结合近几年华东地区禽沙门菌分离株的耐药研究来看[7-8]，耐药抗生素种类在逐年增加，这不仅给养殖业沙门菌病的防控带来困难，终究会对人类健康造成威胁。因此，本研究对2016 年～2018 年华东地区不同地方的家禽沙门菌进行了持续的流行病学调查及耐药性研究，并做了统计学分析，为预防和控制沙门菌病的流行及传播提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源2016 年～2018 年于扬州大学动物医院畜禽门诊及养殖场送检样本中采集患病鸡、鸭、鹅和鸽的疑似沙门菌感染的肝脏样品各195份、67 份、138 份和37 份，主要来于华东地区的扬州、南京、镇江、淮安、滁州、天长及六安等地的养禽场。

1.2 主要试剂普通LB 培养基所需蛋白胨和酵母提取物为英国OXOID 公司产品；纯化琼脂粉购自国药集团；沙门菌显色培养基购自广东环凯微生物科技公司；2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）购自南京诺唯赞公司；琼脂糖购自Biowest 公司；21 种药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；沙门菌属诊断血清购自宁波天润药业有限公司。

1.3 革兰氏染色镜检以常规无菌操作方法，用无菌接种环蘸取少量组织，划线接种于显色培养基培养，挑取疑似菌落纯化培养后挑取少许沙门菌菌液于载玻片，革兰氏染色后镜检，观察细菌染色情况与形态。

1.4 沙门菌的多重PCR（mPCR）检测采用杨林等建立的mPCR 方法[9]，以煮沸裂解法制备可疑细菌的DNA 模板，采用沙门菌属特异性基因hut 及型特异性基因SdfI、Spy、glgc 和Spec 引物进行PCR 扩增，鉴定沙门菌类型。对检测结果为沙门菌分离株的宿主来源、年份和季节因素进行分析。

1.5 分离菌玻板凝集试验对于未知血清型的沙门菌，采用玻板凝集试验鉴定：首先用沙门菌A-F群O 抗原多价血清和H 抗原多价血清进行血清凝集试验，再用O 抗原单因子血清和H 抗原单因子血清进一步鉴定，同时用生理盐水作对照。按照Kauffman-White 分类体系进行血清学分型。

1.6 药敏试验采用纸片琼脂扩散法进行药敏试验。挑取单个菌落，在LB 固体培养基上均匀划线涂布于整个培养基表面。取药敏纸片贴到LB 固体培养基表面，37 ℃培养16 h～18 h 后量取抑菌圈直径，重复3 次，取平均值。参考杭州天和微生物试剂有限公司《药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准》判断该菌对不同药物的敏感性。

2 结 果

2.1 分离菌的形态学鉴定经纯化培养后观察可见，在显色培养基上分离菌呈紫红色或紫罗兰色、扁平透明的菌落。革兰氏染色结果呈红色、两端钝圆的短杆菌，为革兰氏阴性菌（图1）。

图1 沙门菌的革兰氏染色试验结果Fig.1 Gram staining of Salmonella

2.2 沙门菌的mPCR鉴定经mPCR鉴定，可疑菌株中有233株可扩增出495 bp的属特异性条带（图2），表明均为沙门菌。

图2 沙门菌分离株的mPCR 鉴定结果Fig.2 Identification of Salmonella isolates by mPCR

2.3 沙门菌的血清分型及沙门菌分离株的宿主来源和季节分布结合mPCR 试验与血清凝集试验鉴定分离株血清型，血清型鉴定结果表明，110 株可同时扩增出401 bp 的型特异性条带，为鼠伤寒沙门菌（47.21%）；82 株可同时扩增出252 bp 的型特异性条带，为鸡白痢沙门菌（35.19%）；25 株可同时扩增出304 bp 的型特异性条带，为肠炎沙门菌（10.73%）（图2）。剩余的16 株经玻板凝集试验鉴定分别为5株德尔卑沙门菌（2.14%）、3 株纽波特沙门菌（1.29%）、2株波斯坦沙门菌（0.86%）、2株都柏林沙门菌（0.86%）、2 株猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型（0.86%）、1 株邦戈尔沙门菌（0.43%）和1 株斯坦利沙门菌（0.43%）（表1）。以上结果表明，华东地区禽沙门菌的优势血清型是鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌。

来源分布显示鸡源分离株以鸡白痢沙门菌为主，鸭源、鹅源和鸽源分离株均以鼠伤寒沙门菌为主（表2）。季度分布统计结果显示，每年第二季度和第三季度沙门菌的分离率较高，第一季度和第四季度的分离率相对较低（图3）。

表2 沙门菌分离株宿主来源统计结果Table 2 Host sources of Salmonella isolates

图3 沙门菌分离株季节分布统计结果Fig.3 Quarterly distribution of Salmonella isolates

2.4 药敏试验结果及分析

2.4.1 药敏试验结果药敏试验结果显示，近3年沙门菌临床分离株普遍对青霉素、苯唑西林、利福平和红霉素耐药，尤其对青霉素、苯唑西林、利福平和红霉素的耐药菌株占比均达到了85%以上，最高至100%。2018年的沙门菌分离株对头孢西丁、四环素和复方新诺明的耐药性有明显的提高，耐药菌株分别由0、6.41%和61.54%上升至57.5%、93.7%和87.5%。敏感性抗生素主要有庆大霉素、环丙沙星、氟苯尼考和氯霉素，敏感菌株占比均在80%左右（表3）。结果表明，抗生素的大量使用会使沙门菌的耐药特性发生改变。

表3 沙门菌分离株对抗生素的药敏试验结果Table 3 Resistance rates of Salmonella isolates to antibiotics

2.4.2 沙门菌分离株的多重耐药统计结果233 株禽源沙门菌分离株中，213 株对3 类及3 类以上抗生素（β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、利福霉素类、大环内酯类、四环素类、酰胺醇类、磺胺类）耐药，多重耐药菌株占比达91.42%。其中2016年、2017 年和2018 年分离株的多重耐药菌株占比分别为91.03%、92.96%和90.48%（图4），主要耐药谱为苯唑西林-青霉素-利福平-红霉素。表明沙门菌的多重耐药现象较为严重。

图4 233 株家禽沙门菌分离株对21 种抗菌药物的多重耐药谱Fig.4 Multi-drug profiles of 233 Salmonella isolates from poultry to 21 antimicrobial agents

3 讨 论

沙门菌在自然界中十分普遍，对家禽健康和人类公共安全均具有严重的影响，是重要的人兽共患病原菌[10-11]。焦库华等报道2005 年～2008 年在盐城、南通、连云港、淮安等地的分离结果显示，鸡白痢沙门菌为优势血清型[12]；查华等报道2010 年～2012年在江苏、安徽、上海等地的分离结果显示，禽源沙门菌中鸡白痢沙门菌为优势血清型[13]；张林吉等报道2014 年～2015 年在江苏徐州地区禽源沙门菌的临床检测结果显示，鼠伤寒沙门菌为优势血清型[14]；沈学怀等报道在2015 年～2016 年安徽地区的沙门菌分离情况显示，鸡伤寒沙门菌为优势血清型[8]；段瑶等报道在2006 年～2016 年我国各地畜禽来源的沙门菌血清型鉴定结果表明，肠炎沙门菌为优势血清型[15]。本究结果表明，2016 年～2018 年从患病家禽中共分离到233 株沙门菌，鼠伤寒和鸡白痢为优势血清型，鸭源、鹅源和鸽源分离株以鼠伤寒沙门菌为主，鸡源分离株以鸡白痢沙门菌为主，表明不同宿主、不同地区或不同养殖方式可能存在不同血清型沙门菌的流行，华东地区家禽源沙门菌优势血清型已发生了变化。

比较2016 年～2018 年的沙门菌分离株血清型种类可以发现，2016 年仅分离到鼠伤寒、鸡白痢和肠炎3 种血清型；2017 年除了分离到鼠伤寒、鸡白痢和肠炎血清型外，还有纽波特和邦戈尔血清型；而2018 年共分离到鼠伤寒、鸡白痢、肠炎、德尔卑、纽波特、波斯坦、斯坦利、都柏林和猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型。可能的原因是不同地区禽类养殖场之间引种和交易的频繁，或是由于不同禽类来源的复杂化，引起不同血清型沙门菌的传播，导致越来越多的血清型在华东地区出现，这给沙门菌病的防治带来更大的困难。

对不同季度的沙门菌分离率比较发现，不同季度的沙门菌分离率具有一定的差异，其中第二季度和第三季度分离率相对较高，第四季度次之，第一季度最低。季度差异的出现，除了气温的巨大差异会导致细菌增殖和传播的差异，可能与养殖场在不同季度的饲养管理情况如消毒剂的使用和用药情况也有关系。

临床上抗生素的使用对抑制细菌性疾病的传播与感染发挥了巨大的作用，而药物的长期反复以及不合理使用，使沙门菌的耐药性逐渐增强，耐药谱也逐渐增宽。张博在2018 年的研究表明，辽宁省东部地区禽源沙门菌对四环素的耐药率也已高达88.24%[16]；岳 秀 英 等 在2009 年～2014 年 对 鸡 源 沙 门菌耐药性变迁的调查研究结果表明，复方新诺明、庆大霉素、四环素、多西环素等耐药率随年份的推移呈上升趋势[17]。本研究结果表明，近3 年华东地区沙门菌分离株的多重耐药率一直维持在很高水平，均在90%以上。对头孢西丁、四环素和复方新诺明的耐药率有显著的上升。因此，必须加强抗菌药物的合理使用，遏制沙门菌耐药的不断发展。

鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌是华东地区家禽中优势流行株，分离菌株的多重耐药率高达91.42%，且对一些抗生素耐药率显著上升。本研究结果为华东地区家禽沙门菌的防治提供了科学依据。