姜黄素类似物H8对糖尿病大鼠心脏的保护作用

仲崇琦，孙文慧，杨俊强，王猛，尚芮竹，张美乐，魏秀芳，袁晓环

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的严重并发症之一，影响糖尿病患者的生活质量，使患者发生心力衰竭的风险大大增加，亦是引起患者死亡的重要原因之一［1］。由于糖尿病心肌病的发病机制尚未完全阐明，目前对于糖尿病心肌病的治疗手段主要是改进生活方式，控制血糖、血脂、血压，改善微循环等［2］，但总体治疗效果欠佳。姜黄素作为治疗糖尿病的代表性中药之一，具有改善胰岛素抵抗［3-4］，改善糖尿病大鼠的心肌纤维化，减少抗糖尿病药物对心脏产生的线粒体氧化应激［5］，抵抗炎症反应［6］，减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡［7］等作用。但由于其溶解性较低，组织分布受限，故生物利用度较低［8］，限制了其临床应用。为此，本实验室前期以姜黄素为母体设计合成了姜黄素类似物H8，提高了其生物利用度。本研究应用超声心动图检测姜黄素类似物H8对糖尿病大鼠心肌结构、功能的影响，探讨其对心脏的保护作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，体质量（180±20）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。将大鼠置于牡丹江医学院医药研究中心SPF 级动物房，适应性喂养1 周后用于实验，饲养条件为：温度（22±2）℃，湿度60%±5%，12 h 交替照明，自由进食饮水。实验操作经牡丹江医学院动物保护与使用委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 H8（淡黄色粉末，纯度99.6%），由牡丹江医学院医药研究中心设计合成［9-10］。高脂高糖饲料（每60 kg 含大鼠维持饲料44.22 kg、猪油9 kg、蛋黄粉6 kg、胆固醇0.72 kg、胆酸钠0.03 kg、丙硫氧嘧啶0.03 kg），由小黍有泰（北京）生物科技有限公司加工制备，SPF级大鼠维持饲料由辽宁长生生物技术股份有限公司加工制备。链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）、伊红、苏木素染色液购自北京索莱宝科技有限公司，羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。全自动生化分析仪（AU5800，美国Beckman Coulter 公司），小动物超声成像系统（VEVO770，加拿大VisualSonics 公司），酶标仪（M3，美国Molecular Devices 公司），紫外可见分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司），包埋机（EG1160）、旋转式切片机（M18170E，德国Leica 公司），生物显微镜（IX70，德国Leica 公司），超微量蛋白核酸测定仪（NanoDrop 2000，美国Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型制备 24只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为对照组、模型组和H8 组，每组8 只。对照组以SFP级大鼠维持饲料喂养，模型组和H8组以高脂高糖饲料喂养。8周后，模型组和H8组隔日腹腔注射柠檬酸缓冲液溶解的STZ（10 g/L），剂量为25 mg/kg，注射3次；对照组腹腔注射等剂量的柠檬酸缓冲液。给药72 h后测定大鼠空腹血糖，连续3 d空腹血糖＞11.1 mmol/L提示2型糖尿病模型建立成功。造模成功后H8组大鼠以6 mg/kg的H8（用1%CMC-Na溶解）灌胃，每日1 次，连续4 周；对照组和模型组每日以等量1%CMC-Na 溶液连续灌胃4 周。分别于注射STZ 前和注射2、4周后测量大鼠体质量。灌胃第4周末，进行超声心动、血液生化及心肌组织学等检测。

1.3.2 超声心动图检测 各组大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉，褪去胸毛后平置于操作台上，取仰卧位，采用超声心脏探头，探头频率为13 MHz，行M型超声技术采集大鼠舒张期左心室前壁厚度（LVAWd）、舒张期左心室后壁厚度（LVPWd）、舒张期左心室内径（LVIDd）、收缩期左心室内径（LVIDs）、左室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（FS）。以大鼠左心室前壁和后壁的收缩期室壁增厚率（WT）评价大鼠左心室室壁运动情况，WT=（收缩期室壁厚度-舒张期室壁厚度）/舒张期室壁厚度×100%。

1.3.3 血液生化指标测定 将各组大鼠禁食不禁水12 h，眼眦静脉取血1 mL，5 000×g，离心10 min，取血清后使用全自动生化分析仪检测血糖（GLU）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。

1.3.4 心肌组织病理学染色 各组大鼠麻醉后取出心脏，仔细剪去多余的血管、脂肪，用预冷的生理盐水冲洗残余血液，剪取左心室心肌组织置于含有4%多聚甲醛的EP管中，固定48 h，常规乙醇梯度脱水，包埋机包埋，切片，厚度为4 μm，苏木素-伊红法（HE）染色，中性树胶封片，在200倍和400倍光镜下，观察各组大鼠心肌组织的形态变化。

1.3.5 心肌组织LDH活性测定 采用微量酶标法，切取小块左心室组织放入EP管中，加入生理盐水后用研磨棒研磨，制成0.05%的心肌组织匀浆，使用NanoDrop 2000 测定其蛋白浓度，按照LDH 试剂盒说明书进行操作，酶标仪于波长450 nm处测定光密度（OD）值，组织中LDH活性（U/g prot）=（测定OD 值-对照OD 值）/（标准OD 值-空白OD 值）×标准品浓度÷待测样本蛋白浓度。

1.3.6 心肌组织T-SOD和MDA含量测定 均采用紫外分光光度法，切取小块左心室组织放入EP管中，加入生理盐水后用研磨棒研磨，制成5%的心肌组织匀浆，使用NanoDrop 2000 测定其蛋白浓度，严格按照T-SOD 和MDA 试剂盒说明书进行操作，分别于波长550 nm 和532 nm 处，1 cm 光径，使用紫外分光光度计测定各组光密度（OD）值。T-SOD 活力（U/mg prot）=（对照OD 值-测定OD 值）/对照OD 值÷50% ×（反应液总体积/取样量）÷待测样本蛋白含量。MDA 含量（μmol/g prot）=（测定OD 值-对照OD 值）/（标准OD 值-空白OD值）×标准品浓度÷待测样本蛋白浓度（g prot/L）。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 5.0统计学软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析和重复测量设计的方差分析，组间多重比较行LSD-t法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 对照组大鼠毛色光亮，进食、饮水、排尿、排便正常，精神状态佳，反应灵敏；模型组大鼠注射STZ后毛色光泽度明显减弱，有明显的“三多一少”表现，精神逐渐萎靡，其中1只出现糖尿病性白内障，1只在实验过程中死亡；与模型组相比，H8组上述表现均有不同程度改善，无死亡。对照组大鼠体质量稳定增长，模型组和H8组在注射STZ 后体质量逐渐下降，各组大鼠注射STZ 前后体质量变化情况见表1。

Tab.1 Comparison of body weights of rats before and after STZ injection between three groups表1 各组大鼠注射STZ前后体质量比较 （g）

Tab.1 Comparison of body weights of rats before and after STZ injection between three groups表1 各组大鼠注射STZ前后体质量比较 （g）

F组间=2.668，P＜0.05；F时间=41.720，P＜0.05；F交互=0.340，P＞0.05；组间比较：a与对照组相比，P＜0.05；组内比较：A与注射STZ前比较，B与注射STZ 2周比较，P＜0.05

2.2 各组大鼠左心室结构比较 与对照组相比，模型组大鼠LVPWd、LVEF和FS降低，LVIDs增大（P＜0.05）；与模型组相比，H8组大鼠LVPWd、LVEF和FS增高，LVIDs 减小（P＜0.05）；3 组大鼠LVAWd 和LVIDd差异均无统计学意义，见表2。

2.3 各组大鼠左心室室壁运动情况比较 与对照组相比，模型组大鼠左心室前壁和后壁WT 降低（P＜0.05）；与模型组相比，H8组大鼠左心室前壁和后壁WT升高（P＜0.05），见表3。

2.4 各组大鼠生化指标比较 与对照组相比，模型组大鼠血清中GLU、TC、TG 水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，H8 组大鼠血清中GLU、TC、TG 水平降低（P＜0.05），见表4。

Tab.2 Comparison of left ventricular structure and function between three groups表2 各组大鼠左心室结构及功能比较 （）

Tab.2 Comparison of left ventricular structure and function between three groups表2 各组大鼠左心室结构及功能比较 （）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

Tab.3 Comparison of left ventricular wall thickening between three groups表3 各组大鼠左心心室WT比较（%）

Tab.3 Comparison of left ventricular wall thickening between three groups表3 各组大鼠左心心室WT比较（%）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

Tab.4 Comparison of biochemical indicators of rats between three groups表4 各组大鼠生化指标比较 （）

Tab.4 Comparison of biochemical indicators of rats between three groups表4 各组大鼠生化指标比较 （）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组H8组F n8 7 8 GLU（mmol/L）5.08±0.13 18.94±2.24a 9.70±0.88b 28.010＊TC（mmol/L）1.23±0.22 2.12±0.12a 1.26±0.22b 6.753＊TG（mmol/L）0.50±0.08 1.21±0.24a 0.49±0.09b 6.849＊

2.5 各组大鼠心肌组织HE 染色结果比较 HE 染色显示，对照组大鼠心肌结构正常，心肌细胞排列整齐，肌纤维连续，线粒体在肌纤维之间有序分布；与对照组相比，模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌组织出现断裂，镜下可见不规则的肌原纤维，线粒体在其间错乱分布；与模型组相比，H8 组大鼠心肌细胞排列较整齐，结构紊乱情况明显好转，见图1。

2.6 各组大鼠心肌组织LDH、T-SOD 和MDA 水平比较 与对照组相比，模型组大鼠心肌组织中LDH、MDA 水平明显升高，T-SOD 水平明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，LDH、MDA 水平明显降低，TSOD水平明显升高（P＜0.05），见表5。

3 讨论

Fig.1 Histopathological changes of myocardium in each group（HE staining）图1 各组大鼠左心室心肌组织病理学变化（HE染色）

Tab.5 Comparison of LDH,T-SOD and MDA in myocardial tissues between three groups表5 各组大鼠心肌组织LDH、T-SOD和MDA含量比较

糖尿病心肌病是指发生于糖尿病患者，不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病及其他心脏病变来解释的心肌疾病，是糖尿病患者致残和致死的主要原因之一［11］。糖尿病心肌病常伴有局部炎症、氧化应激、心肌纤维化和心肌细胞凋亡等，这些变化可引起心肌收缩功能障碍、左心室肥大和扩张型心肌病，进而影响心输出量，最终导致心力衰竭［12-13］。本研究结果显示，模型组大鼠左心室室壁运动减弱、心室重构明显、心功能降低，GLU、TC、TG水平明显升高，心肌细胞结构紊乱，心肌组织中LDH、MDA水平明显增加，T-SOD水平明显降低，符合糖尿病心肌病的病理生理改变。给予糖尿病大鼠黄素类似物H8 治疗后，其左心室室壁运动情况、心室重构情况及心功能均较模型组明显改善，提示姜黄素类似物H8 对糖尿病大鼠心肌损伤具有保护作用。

血脂异常是增加糖尿病患者动脉粥样硬化性心脏病易感性的危险因素之一。 Panahi 等［14］研究结果显示，给予2型糖尿病患者1 g/d姜黄素12周干预后，其血清血脂水平明显降低。另有研究表明，姜黄素类似物H8 作为11β-羟基类固醇脱氢酶1 型（11βHSD1）抑制剂不但可通过抑制糖异生降低糖尿病小鼠的血糖浓度［9］，亦可通过抑制糖皮质激素过表达，减少db/db小鼠内脏脂肪，改善脂代谢紊乱［15］，从而达到降糖、降脂的作用。本研究结果显示，H8组大鼠血清中GLU、TC、TG水平较模型组明显降低，提示姜黄素类似物H8 可能通过改善糖尿病大鼠血糖、血脂异常来发挥其对心肌损伤的保护作用。

氧化应激参与了糖尿病及糖尿病心肌病的发生和发展。有研究显示，氧化应激可使β 细胞功能恶化，是2型糖尿病发病机制之一，造成糖尿病患者的糖毒性和脂毒性；此外，晚期糖基化终产物可通过氧化应激诱导内皮功能障碍，并导致2 型糖尿病患者微血管和大血管并发症的发生［16-17］。LDH、SOD 和MDA是氧化应激的标志物。Ye等［18］研究表明，SOD水平升高可部分修复糖尿病小鼠的线粒体功能紊乱和心肌细胞的收缩功能。目前已有多项研究证实姜黄素具有抗氧化作用［19-21］。本研究结果显示，与模型组相比，H8组大鼠经姜黄素类似物H8治疗后，其SOD 活性明显增加，MDA 及LDH 水平明显降低；提示姜黄素类似物H8 可能通过改善糖尿病大鼠心肌氧化应激损伤来发挥其对心肌损伤的保护作用。

综上所述，姜黄素类似物H8对糖尿病大鼠心脏具有保护作用，其作用机制一方面可能与降低血糖、血脂及改善心室重构和心功能有关，另一方面可能与改善心肌氧化应激损伤有关，即可能通过影响SOD、MDA和LDH活性而发挥作用。