CYP2C19基因型与复发性脑梗死患者氯吡格雷抵抗的关系研究

郝亚南，沈和平，张晓玲

脑梗死具有高发病率、高致残率和高死亡率特点，严重影响人类健康。复发性脑梗死（recurrent cerebral infarction，RCI）的死亡率及致残率均高于首次发病。近年来数据显示，我国脑梗死年复发率高达17.7%[1]，有效的二级预防是减少复发和死亡的重要手段。抗血小板药物能够有效预防脑梗死的发病及复发，现已得到循证医学的支持[2]。氯吡格雷是国内外脑梗死二级预防指南推荐使用的一线抗血小板药物，用于高危患者脑梗死复发的预防[3]。然而，临床工作中发现，部分患者即使长期、规律地服用氯吡格雷，仍有卒中复发的风险。目前已有较多的基础和临床研究证实部分患者存在氯吡格雷抵抗，而且有研究显示，氯吡格雷抵抗与CYP2C19基因多态性有关[4-5]。2010年美国食品和药品监督管理局对氯吡格雷增加了“黑框警告”，建议加强对氯吡格雷治疗的患者进行CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的检测，对CYP2C19基因纯合突变患者考虑换用其他抗血小板药物或改变氯吡格雷的剂量方案。目前，我国《中国缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作二级预防指南2014》[1]中并未对CYP2C19基因检测予以规定，并且RCI患者服用氯吡格雷后血小板聚集情况与CYP2C19基因关系的研究较少。本研究探讨氯吡格雷对CYP2C19不同基因型复发性脑梗死患者血小板聚集功能的抑制情况，根据氯吡格雷抵抗情况进行不同的药物治疗策略，随访3个月患者卒中复发情况，为个体化治疗提供理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 本研究是前瞻性研究，连续纳入2018年1-10月就诊于嘉兴市第二医院神经内科诊断为RCI的患者进行CYP2C19基因测序，收集氯吡格雷快代谢、中代谢、慢代谢型患者各30例。

入组标准：①年龄40～90岁；②复发性脑梗死患者，脑梗死符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》中急性缺血性卒中诊断标准；③此次发病时间在7 d内，生命体征平稳，NIHSS评分≤25分；④脑梗死考虑为中国缺血性卒中分型诊断（China Ischemic Stroke Subclassification，CISS）中大动脉粥样硬化型或穿支动脉疾病；⑤首次脑梗死后规律应用阿司匹林进行二级预防；⑥接受CYP2C19基因测序检查并明确其基因分型（快代谢、中代谢、慢代谢基因型）者。

排除标准：①既往使用氯吡格雷或氯吡格雷过敏；②首次脑梗死；③严重高血压、糖尿病、肺部感染；④心源性栓塞及非动脉粥样硬化性血管狭窄患者，包括各种血管炎、血管痉挛、夹层动脉瘤或烟雾病；⑤颈内动脉曾行内膜剥脱术或支架治疗、存在脑血管畸形或动静脉瘘的患者；⑥不能完成复查或者依从性差的患者。

本研究经嘉兴市第二医院伦理委员会审批，对入组患者进行充分告知，取得知情同意，签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 研究流程 ①对RCI患者进行氯吡格雷基因检测，纳入快代谢、中代谢和慢代谢基因型各30例；②入组所有患者均服用氯吡格雷75 mg/d连续7 d，于服药前及7 d后晨起空腹状态下留取静脉血标本检测血小板聚集率，根据血小板聚集抑制率，筛选出氯吡格雷抵抗者分至氯吡格雷抵抗组，改用西洛他唑100 mg，2次/日，氯吡格雷敏感及氯吡格雷半反应者分至非氯吡格雷抵抗组，继续氯吡格雷75 mg/d治疗；③3个月后随访患者终点事件发生情况（主要终点：再发脑梗死；次要终点：脑出血和死亡），并再次检测血小板聚集率。

观察分析指标：①比较快代谢、中代谢和慢代谢3组患者基线资料及氯吡格雷抵抗的发生率；②比较氯吡格雷抵抗及非氯吡格雷抵抗组年龄、性别、BMI、吸烟（每天吸烟1支以上，连续或累计6个月及以上）、CYP2C19基因慢代谢、高血压、糖尿病及高脂血症等一般临床资料，分析CYP2C19基因型与复发性脑梗死患者氯吡格雷抵抗的关系；③比较氯吡格雷抵抗及非氯吡格雷抵抗组3个月时血小板聚集抑制率以及两组3个月后终点事件发生情况（图1）。

1.2.2 CYP2C19基因检测方法 利用CYP2C19基因芯片检测系统（中国上海百傲科技有限公司）检测：①提取全血DNA；②PCR扩增目的基因；③芯片杂交显色；④将芯片上的色斑经信号放大；⑤通过基因芯片图像分析软件 Array Doctor V2.0对结果进行扫描和自动判读，判定CYP2C19 基因型信息。并设阳性（含CYP2C19*2G和CYP2C19*2A、CYP2C19*3G和CYP2C19*3A的质粒混合液）及阴性（空白对照）对照进行质量控制。基因检测结果CYP2C19*1/*1为快代谢基因型，CYP2C19*1/*2及CYP2C19*1/*3为中代谢基因型，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3及CYP2C19*2/*3为慢代谢基因型。

图1 研究流程图

1.2.3 血小板聚集率的检测方法 采用光学比浊法检测血小板聚集率：入组患者服用氯吡格雷前及7 d后晨起空腹状态下留取静脉血标本，加入枸橼酸抗凝，离心获取富血小板血浆，吸取0.5 mL血浆于放有镍芯磁棒的反应杯中37 ℃温育5 min，设置磁棒的旋转速度为1200 r/min，将反应杯转到检测孔继续温育5 min，加入促凝剂5-腺苷二磷酸二钠盐（终浓度为20 μmol/L）进行血小板聚集反应检测，待曲线平稳后停止反应，记录血小板最大聚集率。

氯吡格雷抵抗评价标准：参照Müller定义[6-8]。血小板聚集抑制率＜10%为氯吡格雷抵抗，10%～30%为氯吡格雷半反应，≥30%为氯吡格雷敏感。血小板聚集抑制率为服用氯吡格雷7 d后最大血小板聚集率较治疗前最大血小板聚集率（基线值）下降的数值。

血小板聚集抑制率（%）=治疗前基线值-用药后最大血小板聚集率。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，两组间正态分布的计量资料以表示，采用独立样本t检验；计数资料以频数（%）表示，比较采用四格表χ2检验。三组间计数资料以频数（%）表示，比较采用多组独立样本χ2检验。以氯吡格雷抵抗为因变量，以性别、年龄、BMI、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症、CYP2C19基因型为自变量，采用多因素Logistic回归分析氯吡格雷抵抗的独立危险因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

最终入组符合入排标准的RCI患者90例，其中男性49例（54.4%），女41例（45.6%），年龄40～89岁，平均年龄68.27±10.14岁。所有患者3个月随访均无终点事件发生。

2.1 不同CYP2C19基因型分组氯吡格雷抵抗情况 快、中、慢代谢3组在合并糖尿病方面差异有统计学意义（P=0.036），两两比较显示慢代谢组合并糖尿病比例高于中代谢组（P=0.010），快代谢与中代谢及快代谢与慢代谢组之间差异无统计学意义；3组在性别、年龄、BMI、高血压、高脂血症等方面差异无统计学意义。快代谢组有2例（6.7%）、中代谢组有5例（16.7%）、慢代谢组有15例（50.0%）出现氯吡格雷抵抗（表1）。3组氯吡格雷抵抗率差异有统计学意义（P＜0.001）；两两比较显示，慢代谢组氯吡格雷抵抗发生率高于快代谢组（P＜0.001）及中代谢组（P=0.006），快代谢与中代谢组氯吡格雷抵抗率差异无统计学意义（P=0.421）。

2.2 不同氯吡格雷抵抗组基线资料比较 入组7 d后根据血小板聚集抑制率分为非氯吡格雷抵抗组68例，氯吡格雷抵抗组22例，其中非氯吡格雷抵抗组患者的吸烟、糖尿病和CYP2C19基因慢代谢型比例明显低于氯吡格雷抵抗组，差异有统计学意义；两组性别、年龄、BMI、高血压、高脂血症等方面差异无统计学意义（表2）。

2.3 氯吡格雷抵抗危险因素的Logistic回归分析 Logistic回归分析结果显示吸烟、糖尿病及CYP2C19慢代谢基因型为复发性脑梗死患者发生氯吡格雷抵抗的独立影响因素（表3）。

表1 不同CYP2C19基因型患者氯吡格雷抵抗情况

表2 不同氯吡格雷抵抗分组基线资料比较

2.4 两组3个月后的血小板聚集抑制率情况 3个月后随访，非氯吡格雷抵抗组（氯吡格雷治疗）和氯吡格雷抵抗组（西洛他唑治疗）患者3个月后的血小板平均聚集率较本组7 d时均下降，差异有统计学意义，说明氯吡格雷抵抗者服用西洛他唑可有效抑制血小板聚集。且3个月后两组比较，氯吡格雷抵抗组血小板聚集抑制率更高（P＜0.001）（表4）。

表3 氯吡格雷抵抗危险因素的Logistic回归分析

表4 两组3个月后血小板聚集抑制率情况

3 讨论

目前氯吡格雷抵抗已越来越受关注，研究表明，使用常规剂量氯吡格雷的患者有4%～30%会出现氯吡格雷抵抗[9-10]，在缺血性脑血管病中其发生率为28%[10-12]，而氯吡格雷抵抗患者中高达40%可能会再发血栓事件[13-14]。本研究检测90例RCI患者的血小板聚集率，发现22例（24.4%）出现氯吡格雷抵抗。

氯吡格雷抵抗会增加缺血事件的发生率[15-16]，但氯吡格雷抵抗的机制尚未完全阐明，可能是由于基因变异或药物相互作用等导致氯吡格雷活性代谢产物的生物利用度降低[17]。目前引起氯吡格雷抵抗的因素主要可分为遗传性因素（如基因多态性）和非遗传性因素（如药物相互作用、患者本身等）。遗传因素中的CYP2C19 基因多态性对氯吡格雷药效的影响很早就受到关注，目前已知CYP2C19变异等位基因数已超过25个，但亚洲人群中与氯吡格雷抵抗相关的突变体为CYP2C19*2、CYP2C19*3[18]。吴小利等[19]研究发现CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因突变易发生氯吡格雷抵抗。Kim等[20]研究发现在携带CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的患者，氯吡格雷对血小板的抑制作用减弱。宋博凡等[21]研究也有相似的结论。本研究也发现，CYP2C19基因慢代谢组（*2/*2、*2/*3、*3/*3）患者氯吡格雷抵抗发生率明显高于快代谢组及中代谢组，提示慢代谢与氯吡格雷抵抗的发生有相关性，与既往报道一致。

目前公认CYP2C19基因多态性对氯吡格雷的疗效起决定性作用[22]。然而本研究发现，CYP2C19基因慢代谢组中仍有50%患者未发生氯吡格雷抵抗，显然氯吡格雷抵抗不仅取决于CYP2C19基因型，还与其他因素有关，如非遗传因素。有文献报道糖尿病患者发生氯吡格雷抵抗的概率较非糖尿病患者高[23-24]。本研究发现，糖尿病是氯吡格雷抵抗的独立危险因素，与Nakagawa等[25]研究结果相一致，考虑可能与糖尿病患者体内发生血管内皮损伤氧化应激导致血小板的活性增强有关。另外，有文献报道吸烟摄入的烟碱作为肝细胞色素CYP1A2活性的诱导剂，与氯吡格雷无反应有关[26]。但关于吸烟对氯吡格雷抵抗的研究较少，本研究中发现吸烟也是RCI患者氯吡格雷抵抗的独立危险因素，考虑与吸烟影响全身血管和血液系统有关，吸烟不仅加速血管硬化，还可以升高血浆纤维蛋白原水平、促进血小板聚集等。有文献报道体重指数增高是氯吡格雷抵抗的危险因素[27]，本研究中未发现BMI与氯吡格雷抵抗有关，考虑与本研究以超重（BMI≥24 kg/m2）非肥胖为标准有关，并且与样本量少也有一定关系。

西洛他唑在脑梗死二级预防的地位日趋升高，有的研究发现西洛他唑在脑梗死二级预防的疗效与安全性方面较阿司匹林及氯吡格雷更优[28-29]。本研究发现，对氯吡格雷抵抗的复发性脑梗死患者，西洛他唑可有效抑制血小板聚集，且无终点事件发生，也证实了西洛他唑的有效性及安全性。

本研究的不足之处：①本研究的样本量较小，随访时间不够长，故无法判断西洛他唑在二级预防中的长期效果；②影响氯吡格雷代谢的因素比较多，除基因（CYP2C19、ABCB1等）多态性外，还包括药物（质子泵抑制剂、他汀类药物等）的相互作用、合并其他基础疾病（糖尿病、高脂血症等）及患者依从性。因此，仅通过检测CYP2C19基因多态性来决定患者的抗血小板治疗策略并不是最优方案，需要结合患者具体情况及血小板聚集率综合分析，并且需要大样本、前瞻性、多中心随机对照研究来证实，以便预测氯吡格雷抵抗的发生，更合理地指导临床用药。