新疆南疆某规模牛场牛传染性鼻气管炎PCR鉴定与分析

张迎春,经春林,赵玉宾,王哲红,黄 腾,胡建军

(1.新疆生产建设兵团第一师畜牧兽医工作站,新疆阿拉尔843300 ； 2.新疆生产建设兵团第一师四团畜牧兽医工作站,新疆阿拉尔843300 ； 3. 塔里木大学动物科学学院,新疆阿拉尔843300)

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)或称牛疱疹病毒1型(Bovine herpes virus 1, BHV-1)所引起的牛的一种接触性传染病。临床主要表现为上呼吸道炎症、鼻炎、窦炎、高热、呼吸困难、流鼻液等，亦可引起母牛流产和死胎、肠炎、小牛脑炎，以及结膜炎、乳房炎等病症，新生犊牛可为全身性疾病，并可有脑炎。该病毒侵入牛体后会在三叉神经节和腰、荐神经节内形成潜伏感染，中和抗体对潜伏感染病毒无作用，导致持续性感染。在应激因素作用下，潜伏于三叉神经节和腰、荐神经节中的病毒可以活化，并出现于鼻液与阴道分泌物中，隐性带毒牛成为最危险的传染源，给本病防治和净化带来极大困难[1-3]。

IBR是牛的重要传染病之一，给养牛业带来极大的经济损失。IBR在世界各国都有发生和存在。近年来，随着新疆奶牛业的发展，IBR发病率呈上升趋势，快速鉴定新疆南疆规模牛场IBR病原，对该病综合防治工作具有重要意义。本试验应用PCR方法，在规模牛场开展IBR疾病检测，为该病的综合防治工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 新疆南疆某规模化牛场部分奶牛出现浆液性或脓性的鼻液，体温较高、咳嗽、食欲减退。无菌棉签采集病牛鼻腔分泌物样品15份，冷冻保存备用。经调查该奶牛场未免疫接种牛传染性鼻气管炎病毒疫苗。

1.2 主要试剂 血液/细胞/组织DNA提取试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、DNA凝胶回收试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、TIANgel Midi Purification Kit试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株 文章中涉及的病毒参考株均下载于NCBI中GenBank，见表1。

表1 GenBank中登录的IBRV参考株序列Table 1 IBRV reference strains from GenBank

1.4 方法

1.4.1 样品处理 灭菌棉签蘸取患牛鼻腔分泌物，置于5 mL离心管PBS缓冲液(浓度)中，-20 ℃保存备用。

1.4.2 样品DNA提取 将样品材料反复冻融3次，参照血液/细胞/组织DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA，于-20 ℃保存备用。

1.4.3 引物 采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR方法[4]，IBRV特异性gB基因引物序列如下：gB-P1：5′-TACGACTCGTTCGCGCTCTC-3′；gB-P2：5′-GGTACGTC-TCCAAGCTGCCC-3′，预计扩增片段大小为478 bp，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.4 PCR反应 50 μL反应体系：Go Tap Green Master Mix 25 μL，引物gB-P1、gB-P2各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL混匀后瞬时离心。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min， 65 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，10个循环；95 ℃变性1 min， 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，15个循环；95 ℃ 变性1 min， 60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，10个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定所扩增片段大小。

1.4.5 PCR产物纯化回收、克隆及测序 DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物并连接到pGEM-T 载体上，转化至DH5α大肠杆菌得到重组菌，菌落PCR鉴定，阳性菌落摇菌，提取质粒。样品送至北京金锘锐杰基因科技有限公司测序。

1.4.6 序列分析 测序结果在NCBI中进行Blast，利用DNASTAR软件对测序样本与GenBank参考株gB基因的核苷酸同源性进行比较分析，并绘制遗传进化树。

2 结果

2.1 PCR扩增 采用IBRVgB基因特异性引物(gB-P1/gB-P2)进行PCR扩增，电泳得到478 bp大小的片段，与预期的目的片段大小相符(图1)。

2.2gB基因核苷酸同源性分析 所测样本序列与牛传染性鼻气管炎病毒参考株gB基因片段进行核苷酸同源性比较。3个阳性样本之间核苷酸同源性达到99%以上，将其中1个阳性样本序列提交到NCBI中GenBank，获得登录号：KY348790，命名为IBRV-4T3-1。IBRV-4T3-1与参考株gB基因核苷酸同源性为86%以上，见表2。

图1 IBRV-Aks-01株的PCR鉴定
Fig.1 PCR amplification for IBRV-Aks-01M：DNA Marker DL-2 000； 1：PCR阴性对照； 2～4：PCR扩增片段 M：DL-2 000 DNA marker； 1：PCR negative control； 2～4：PCR amplified fragments

表2 IBRV-4T3-1株gB基因核苷酸同源性比较
Table 2 Homology analysis ofgBgene sequence of IBRV-4T3-1

注：右上列值为gB基因核苷酸同源性比较

2.3 IBRV-4T3-1gB基因遗传进化树分析 IBRV-4T3-1与参考株gB基因序列核苷酸同源性比较分析并构建遗传进化树，如图2所示。IBRV-4T3-1与NYK-Yak-63、BoHV-1-1643-12、Cooper、NM06、BH81、674-10、SP1777、166-84、BHV1.1/2008/MN2/USA、BHV-1-UPR-29/07、BHV1.1/Abu-Hammad/1/2013/Egypt、Banffshire 82、Odocoileus_hemionus_00_1、Salla 82参考毒株同源性为88.8%以上，均属于α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirus)水痘病毒属(Varicellovirus)。

3 讨论

通过对该规模牛场的奶牛发病情况、临床症状等做出初步诊断，结合PCR鉴定，确定该牛场奶牛感染牛传染性鼻气管炎。15份疑似IBR样本经PCR法检测，核酸阳性检出率为20%。

20世纪50年代美国首先报道了IBR，我国于20世纪70年代从进口种牛中发现此病。目前世界各地已普遍存在，我国大部分地区各种牛群中均有不同程度感染。新疆多位学者[5-11]已开展了牛传染性鼻气管炎流行病学调查、病原检测等研究，通过大量研究证实，该病已在新疆牛场普遍存在，部分牛场抗体阳性率可达到90%，不仅奶牛感染，而且牦牛也存在感染的情况，对牛的育肥、繁殖力、产奶量等影响较大。

目前，世界各地的牛传染性鼻气管炎病毒分离株只有1个血清型。BHV-1分为3个基因亚型。其中，BHV-1.1 与牛传染性鼻气管炎(IBR)有关，BHV-1.2与传染性脓疱性外阴-阴道炎(IPV)有关，而脑炎与BHV-1.3有关。该病的各型中，在急性病时或地方流行后数周可出现流产。脑炎型的常感染小于3月龄并且体内抗体效价低的犊牛。

IBRV致病性最主要特点是多组织嗜性，常侵害于呼吸系统、生殖系统、神经系统和眼结膜。病变组织、分泌物内含大量病毒，通过空气、媒介物以及直接接触而传播。秋、冬季是本病高发季节，过分拥挤、密切接触的舍饲奶牛群中易迅速传播[1]。

图2 牛传染性鼻气管炎病毒gB基因系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree inferred from thegBgene nucleotide sequences of IBRV

严格检疫是防止引入传染源的最重要措施。发现疑似病牛，应隔离观察，控制并发症。流行较严重的地区，可用疫苗控制，疫苗虽不能防止感染，但可起到防御临诊发病的效果。在发病率低的地区，采用检出阳性病牛予以淘汰，是根除本病的有效途径。如补偿机制不全，实施难度较大[3]。目前，丹麦和瑞士采用禁止使用传染性牛鼻气管炎病毒疫苗而采取扑杀抗体阳性牛的措施，使得该病在这2个国家几乎被扑灭[1]。

IBR在自然感染时，隐性感染不表现出临床症状，而重症病牛则表现急性上呼吸道症状，仅依据临床表现很难进行确诊。IBRV基因组中gB(UL27)位于基因组的长独特区，是IBRV强毒、弱毒所共有且比较保守的序列，PCR方法可用于疑似感染IBR或潜伏感染患牛的检测。本试验采用PCR法进行IBR检测，为新疆南疆地区规模牛场感染IBR综合防控措施的制定提供了可靠依据。