中国小麦短体线虫种类的分子鉴定及地理分布

秦 鑫，王亚东，李红梅，李 冉，王 暄

(南京农业大学植物保护学院，农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室，江苏南京 210095)

短体线虫(Pratylenchus)，又称根腐线虫(root-lesion nematodes)，是一类寄主众多、分布广泛的迁移性植物内寄生线虫，能够侵染植物地下组织，引起组织腐烂坏死，并影响植物的生长和产量，同时短体线虫造成的伤口为病原真菌和细菌的侵染提供便利[1]，引起复合病害的发生，进一步加重经济损失，因此，短体线虫也是全球10种最具破坏性的植物寄生线虫之一[2]。近年来，在黄淮麦区孢囊线虫(cereal cyst nematodes，CCN)发生分布的调查中发现，小麦根系及根际土壤中普遍存在短体线虫和孢囊线虫混合发生的现象[3-4]，刘海璐等[5]对采自中国江苏、河南、山东和安徽4省麦区的10个短体线虫样品进行分子鉴定，扩增了核糖体rDNA(rDNA)18S、28S D2-D3和线粒体DNA(mtDNA)COI基因片段并测序，通过序列比对分析和系统进化树分析明确了黄淮麦区短体线虫种类有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫3个种，并证实了不同种群复合侵染小麦的现象较为普遍。短体线虫和孢囊线虫复合侵染的普遍发生将会进一步加重中国小麦产量的损失，对中国粮食生产安全造成潜在的严重威胁。

短体线虫属种类比较多，迄今为止，已确定的有效种有104个[6-7]。传统的形态学鉴定需要足够数量的成虫用于形态学特征比较和测计，尤其当样品中存在短体线虫混合种群时，需要先将不同的种区分后再依据形态特征进行鉴定，因此操作较为繁琐且鉴定周期相对较长[5]。此外，短体线虫属种类间的形态鉴别特征较少，种群内常存在形态特征的变异，容易导致种类鉴定出现偏差[8]。分子生物学技术的快速发展和PCR技术的普及，为短体线虫种类的鉴定提供了有效的技术手段。Janssen等[6]通过分析核糖体rDNA的 28S、ITS和mtDNA-COI(mtCOI)基因序列，澄清了穿刺短体线虫(P.penetrans)、伪短体线虫(P.fallax)以及铃兰短体线虫(P.convallariae)的分类争议，并且通过比较这3个基因区域的序列，认为mtDNA-COI基因是短体线虫的一条可靠的条形码标记。刘海璐等[5]基于mtCOI基因构建的系统进化树可以有效地区分短体线虫的近缘种，相比 rDNA 18S 和 28S 基因更适于短体线虫种类的分子鉴定。因此，本研究利用mtCOI基因分子标记对采自中国12个省(市、自治区)的42个小麦短体线虫样品的种类进行鉴定，以探明中国小麦种植区短体线虫的种类以及地理分布，为今后小麦短体线虫的田间检测以及制定小麦根部线虫病害的防控策略提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 样品采集与线虫分离

在2018年1-5月小麦生长期间，通过五点采样法随机采集中国江苏、安徽、河南、山东、河北、湖北、天津、陕西、山西、新疆、甘肃和青海省(市、自治区)的小麦苗和根围土壤样品；采用浅盘法分离各样品中的线虫，收集线虫悬浮液，在体视显微镜下观察悬浮液中的线虫，随机挑取短体线虫制成临时破片，在光学显微镜下观察线虫的形态特征，共采集到42个小麦短体线虫样品，各样品的采集地点和地理信息见表1。

1.2 单条线虫DNA的提取

从42个样品的线虫分离液中，各随机挑取 3～5条短体线虫，用于DNA分子鉴定。单条线虫DNA的提取参照宋志强等[9]的方法，将单条线虫挑入灭菌ddH2O水滴中清洗1～2次后，挑取线虫放入加有8 μL ddH2O和1 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)的200 μL PCR管中，液氮中冷冻2 min后，65 ℃处理4 min，重复3次；加入 1 μL 10 μg·μL-1蛋白酶K，65 ℃温育1 h， 95 ℃处理10 min后，将得到的DNA粗提液置于 -20 ℃保存，备用。

1.3 短体线虫mtCOI基因片段的扩增

以上述各样品的单条短体线虫DNA样本为模板，用通用引物JB3(5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)和JB5(5′-AGCACCTAAACTTAAAACATAATGAAAATG-3′)[10]扩增mtCOI基因片段，PCR反应体系为：DNA模板为1 μL，5 μmol·L-1的上、下游引物各2 μL，2×Ex Taq Mix 12.5 μL，灭菌ddH2O补足至25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共38个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将所有扩增得到的PCR产物送至南京擎科生物公司进行纯化和 测序。

1.4 短体线虫mtCOI序列比对及系统进化树的构建

将测序所得的短体线虫mtCOI序列在NCBI中进行比对并提交GenBank获得序列号，下载有关短体线虫种类的同源序列，进行序列相似度分析。同时将所测的短体线虫与已报道的不同短体线虫的mtCOI序列利用软件Geneious 7.1.4(Biomatters；http://www.geneious.com)[11]整理，去除同源性较低的位点。用在线软件TranslatorX[12](http://translatorx.co.uk)选择无脊椎动物线粒体遗传密码，采用氨基酸编码序列比对mtCOI序列。用软件jModelTest2[13]进行核苷酸替换模型的评估，在赤池信息准则(Akaike Information Criterion，AIC)下选择模型GTR+I+G为构建mtCOI系统进化关系的最佳模型。在CIPRES Science Gateway (www.phylo.org)运算平台上，用MrBayes 3.2.3[14]构建贝叶斯系统进化树，在4条马尔科夫链(Markov Chain)下独立进行3条热链和1条冷链的1×106次运行，每1 000代取样一次且“burn-in”值设置为25%，采用多数一致(50%)原则，通过软件FigTreev.1.4.3进行系统进化树的可视化处理。

1.5 小麦短体线虫种类的鉴定和地理分布分析

根据mtCOI序列的比对、序列相似度和系统进化树的分析结果，对采集自12个省(市、自治区)的42个小麦短体线虫样品的种类进行鉴定，并对短体线虫种类发生情况进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 小麦短体线虫种类的形态鉴定结果

对采自12个省(市、自治区)的42个小麦根围和土样样品进行线虫分离后，分别从各样品中随机挑取约20条短体线虫通过显微镜观察其形态特征，同时查阅多岐检索表及核对有关参考文献[1]，发现这42个样品主要含3种短体线虫，分别为咖啡短体线虫(P.coffeae)、落选短体线虫(P.neglectus)、斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)，它们之间最主要的区别在于雌虫的尾部和侧带区形态特征(图1～图3)。

咖啡短体线虫的雌虫唇区较低平，与体壁稍微缢缩，唇环2个；口针相对强壮，基部球圆形(图1A)；中食道球卵圆形，食道腺长叶状，腹面覆盖肠(图1B)；后阴子宫囊是阴门处体宽的1.0～ 1.5倍(图1C)；尾圆锥形，末端宽圆，或平截，或缺刻，顶端无环纹(图1D)；侧带区一般4～5条侧线，偶尔6条(图1E)。

A：体前端；B：食道；C：阴门；D：尾；E：侧线(标尺= 10 μm)。图2和图3同。

落选短体线虫的雌虫唇区前部轮廓呈角状，唇环2个；头架中度骨化，口针发达，中等长度，口针基部球较宽，前端平或凹陷(图2A)；中食道球发达，食道腺覆盖肠(图2B)；后阴子宫囊约等于阴门处体宽(图2C)；尾端锥形，末端圆，顶端光滑(图2D)；侧带区一般4条侧线(图2E)。

图2 落选短体线虫雌虫的光学显微镜照片

斯克里布纳短体线虫的雌虫唇区较低略缢缩，唇环2个；头骨化明显，口针强壮，口针基部球圆，前端凹陷(图3A)；中食道球卵圆形，食道腺覆盖肠，覆盖长度中等(图3B)；后阴子宫囊中等长度，通常大于阴门处体宽(图3C)；尾宽圆，或半圆，顶端平滑，没有缺刻(图3D)；侧带区一般4条侧线(图3E)。

图3 斯克里布纳短体线虫雌虫的光学显微镜照片

进一步观察发现，在同一样品中如果有短体线虫混合种群发生时，单纯依靠形态特征观察、测计值比较和文献核查进行传统的形态鉴定，很难将咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫准确区分开，因此本研究对42个样品的种类进行了分子鉴定。

2.2 短体线虫样品的mtCOI基因片段扩增结果

以42个短体线虫样品中随机挑取的单条线虫DNA为模板，分别用通用引物JB3/JB5扩增mtCOI基因片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均得到1条约440 bp的条带(部分结果见图4)。将所有的扩增产物送至南京擎科生物科技公司进行测序，将获得的测序结果进行拼接后所有序列的长度为412～432 bp。

M:DNA marker DL2000; 1～24:来自不同样品的单条线虫。 1-24：Individual nematodes from different Pratylenchus samples.

2.3 短体线虫种群的mtCOI序列分析

将测序获得的短体线虫mtCOI序列进行BLAST比对，并与GenBank下载的来自不同国家不同短体线虫种群mtCOI序列进行比对和相似度分析。结果显示，有9条短体线虫的序列与咖啡短体线虫日本群体(GenBank登录号KU198942和KU198943)和中国群体(GenBank登录号KY424072和KY424073)序列相似度最高，为98.8%～100%，这9条短体线虫的序列差异值为0.000，序列相似度为100%；有30条短体线虫的序列与落选短体线虫玻利维亚群体(KU198940)、美国群体(KU198941)和中国群体(KX349423和KY424104)序列相似度最高，达96.5%～99.3%，这30条短体线虫的序列差异值为0.000～0.037，相似度为96.3%～100%；有13条短体线虫的序列与斯克里布纳短体线虫中国群体(KY424090)序列的相似度为95.0%～ 98.7%，这13条短体线虫的序列差异值为 0.000～0.007，相似度为99.3%～100%。序列比对和相似度分析揭示，来自中国12个省(市、区)的42个短体线虫样品中主要有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫3个种，并且样品中存在单一种群侵染和复合种群侵染的现象。42个短体线虫样品的种群及其代码见表1。

表1 小麦短体线虫样品的采集信息和种类鉴定

2.4 短体线虫种群系统进化树分析

将测序所得的短体线虫mtCOI序列(代码见表1)与从NCBI下载的来自美国、英国、日本、南非和玻利维亚等国家的不同短体线虫种群的mtCOI序列进行比对后构建贝叶斯系统进化树，选择北方根结线虫(Meloidogynehapla)和山茶根结线虫(M.camelliae)作为外群。从图5可以看出，有30个短体线虫种群(即：安徽种群AH8-2等，河南种群HN4-2等，山东种群SD2-1等，江苏种群JS3-2等，天津种群TJ1-1等，山西种群SXY1-1，陕西种群SX1-4等，甘肃种群GS1-1等，青海种群QH1-1以及新疆种群XJ3-1等)与落选短体线虫中国、美国、玻利维亚群体聚类在一个大分支，置信度达到100%。在这个大分支中有两个明显的亚分支，其中，有8个种群(GS1-1、GS2-1、QH1-1、SX3-2、TJ1-1、TJ2-1、XJ3-1和XJ7-1)与落选短体线虫中国群体(KX349423和KY424104)、美国群体(KU198941)以及玻利维亚群体(KU198940)聚类在一个分支，置信度达到84%，其他22个种群则聚在另一个亚分支。

从图5还可以看出，有9个短体线虫种群(安徽种群AH6-1等，山东种群SD6-1，河北种群HEB1-1以及湖北种群HUB1-1)与咖啡短体线虫日本群体(KU198942 和KU198943)和中国群体(KY424072和KY424073)聚类在一个分支，置信度达到100%。此外，HN4-1、SD4-2、SX2-1等13个种群均与斯克里布纳短体线虫中国群体(KY424090)聚类在同一个分支，置信度达到100%。

图5 基于mtDNA-COI序列构建的中国小麦短体线虫种群Bayesian系统进化树

总之，通过贝叶斯系统进化树分析，进一步证实了采自中国12个省(市、自治区)的42个短体线虫样品中有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫这3个种。

2.5 中国小麦短体线虫的种类发生和地理分布

根据mtCOI序列的分子鉴定结果，对42个短体线虫样品的种类发生情况进行了统计分析，发现落选短体线虫单一侵染样品有21个，占总样品数的50%，是中国麦区的优势种群，咖啡短体线虫和斯克里布纳短体线虫单一侵染样品分别有6个和5个，分别占总样品数的14.3%和 11.9%。短体线虫的两两复合侵染样品有10个，占总样品数的23.8%，其中，落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫复合侵染的样品有7个，而咖啡短体线虫分别与落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫复合侵染的样品有2个和1个。无论是单一种群侵染还是复合种群侵染，落选短体线虫都呈现明显的种群优势。

此外，在安徽省的7个样品中，咖啡短体线虫和落选短体线虫单一侵染样品分别有4个和1个，二者复合侵染的样品有2个，咖啡短体线虫为安徽省的优势种群；在河南省的5个样品中，落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫单一侵染的样品分别有2个和1个，二者复合侵染的样品有2个；在山东省5个样品中，咖啡短体线虫和落选短体线虫单一侵染的样品分别有1个和2个，落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫复合侵染的样品有2个；在陕西省的4个样品中，落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫单一侵染样品各1个，二者复合侵染的样品有2个；在江苏省的2个样品中，1个为落选短体线虫单一侵染，1个为落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫复合侵染；在湖北省仅采集的1个样品是咖啡短体线虫和斯克里布纳短体线虫的复合侵染；在河北省采集的样品中，咖啡短体线虫和斯克里布纳短体线虫单一侵染样品各有1个；在新疆采集的样品中，落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫单一侵染样品分别有7个和2个；而天津、山西、甘肃和青海4省的7个样品均为落选短体线虫单一侵染。

总之，落选短体线虫在华东、华中和西北地区都有广泛分布，是中国麦区的优势种群，咖啡短体线虫主要分布在华东地区，而斯克里布纳短体线虫虽然不是优势种群，但是分布比较广泛，在安徽、河南、山东、江苏、河北、湖北、陕西和新疆等省都有零星发生。

3 讨 论

国外已有大量关于短体线虫危害麦类作物的报道，种类主要包括六裂短体线虫(P.hexincisus)、卢斯短体线虫(P.loosi)、落选短体线虫(P.neglectus)、穿刺短体线虫(P.penetrans)、斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)、桑尼短体线虫(P.thornei)和玉米短体线虫(P.zeae)等，其中对小麦危害较大的是落选短体线虫、穿刺短体线虫和桑尼短体线虫[15]。中国安徽、四川、广西、河南和西藏等地也有短体线虫危害小麦的报道，已知种类包括落选短体线虫、穿刺短体线虫、咖啡短体线虫、玉米短体线虫、卢斯短体线虫、敏捷短体线虫(P.agilis)和草地短体线虫(P.pratensis)等[5]。刘海璐等[5]对采自黄淮流域的江苏、山东、河南和安徽4省的10个小麦短体线虫样品的种类进行了分子鉴定。

本研究在刘海璐等[5]的工作基础上，进一步对采自华东、华北和西北地区的12个省(市、自治区)的42个短体线虫进行了鉴定，更加明确了短体线虫种类在中国的发生分布情况。李广帅等[16]对从河南省9个地区采集的23个小麦短体线虫进行了分子鉴定，认为有15个样品为敏捷短体线虫(P.agilis)，其他均为卢斯短体线虫(P.loosi)，刘海璐等[5]对采自河南商丘的3个样品进行了鉴定，并未发现上述2种短体线虫，本研究中采自河南的5个样品中也未发现李广帅等[16]发现的2种短体线虫，据此本研究推测这些样品的鉴定结果不同可能与采样地点不同有关。综合刘海璐等[5]和本研究的分析检测，可以得知咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫这3种短体线虫在江苏、山东、河南和安徽4省的不同地区都有发生。

综上所述，本研究采自12个省(市、自治区)的小麦短体线虫种类主要有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫，其中，落选短体线虫是优势种群，在华东、华中和西北地区都有广泛分布，咖啡短体线虫主要分布在华东地区，而斯克里布纳短体线虫地理分布比较广泛，在安徽、河南、山东、江苏、河北、湖北、陕西和新疆等省都有零星分布。本研究基本明确了中国小麦主要种植省份的短体线虫种类分布情况，为小麦短体线虫病的防治提供了理论指导。