小麦西昌69的EMS诱变系蛋白品质变异分析及种质筛选

于利伟，陈爱艳，郭 雷，羊 阳，李慧敏，谢彦周，刘树伟，漆小泉，王中华，高 欣

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100；2.山东大学生命科学学院，山东青岛 266237；3.中国科学院植物研究所，北京 100093)

小麦是全球主要粮食作物之一，提供了人们日常所需的主要植物性蛋白质[1]。随着人们生活水平不断提高，对小麦面制品的品质要求越来越高，对优质小麦的需求呈不断上升趋势。由于小麦遗传基础狭窄，优质基因源匮乏，传统的杂交育种途径很难获得突破性种质。人工诱变能够创造大量变异，通过人工诱变获得有利用价值的变异材料已成为小麦新种质选育的有效途径。

引起种群基因频率大幅度变化的关键原因是基因突变[2]。基因突变可分为自发突变和诱发突变，自发突变发生的频率很低，而诱发突变指的是人工诱导产生的变异，其发生率较高。在诱发突变中，化学诱变剂可诱导植物产生可遗传的变异体，其中甲基磺酸乙酯(EMS)是目前在作物诱变育种中效果较好、被广泛应用的化学诱变剂[3-5]。EMS诱变产生的点突变频率高，多为G-C到A-T的转换，染色体畸变相对较少，多数变异是易于筛查的显性点突变[6-7]，因此被广泛应用于突变体的构建。赵天祥等[8]利用EMS诱变小麦偃展4110种子，对M2代全生育期田间表型进行观察鉴定，获得了株高在10～15 cm的特矮变异体。秘彩丽等[9]利用EMS处理小麦F1花药，经培养筛选得到耐盐突变体。目前，许多研究利用EMS诱变技术构建了突变体库，并在功能基因组学研究中发挥了重要作用[10]。但对小麦蛋白质变异的研究相对较少，对突变体品质的分析及优质材料的筛选尚缺乏快速准确的方法。本研究以优良小麦品种西昌69的EMS诱变系M6代为试验材料，对其HMW-GS进行分析，旨在为小麦突变体的品质鉴定提供技术依据，为小麦品质育种提供优质种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为中国科学院植物研究所植物代谢与抗病研究组和山东大学植物细胞工程与种质创新教育部重点实验室提供的小麦西昌69的EMS诱变系M5代种子。2017年10月份于杨陵西北农林科技大学标本区(108°4′E，34°160′N)种植，每个诱变系种植一行，行长1 m，行间距0.25 m，株距0.03 m，以西昌69为对照。两次重复。成熟后收获，得到1 667份M6代诱变系材料。

1.2 试验方法

通过分析M6代诱变系籽粒品质性状、高分子量麦谷蛋白亚基组成、不溶性蛋白聚合体含量等，快速筛选出优于亲本的诱变系材料。

1.2.1 籽粒品质性状测定

使用近红外谷物分析仪分析小麦籽粒品质参数，包括水分含量、粗蛋白含量、湿面筋含量、吸水率、淀粉含量、沉降值、容重、形成时间、稳定时间、出粉率及最大阻力等。两次重复。

1.2.2 千粒重测定

使用计数板数出200粒小麦籽粒，去除破碎、有病害或虫蛀过的籽粒，称重，乘5得到千粒重。三次重复。

1.2.3 高分子量谷蛋白亚基类型鉴定

从收获的1 667份M6代种子中各取1粒籽粒，利用SDS-PAGE鉴定其高分子量麦谷蛋白亚基组成，参照高 璇等[11]的方法并稍做修改。主要步骤如下：用50%的正丙醇去除样品中的醇溶蛋白；用样品提取液[50%正丙醇，0.08 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)，1.0%DTT] 65 ℃水浴提取30 min；用烷基化溶液[50%正丙醇，0.08 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)，1.4%的4-VP]烷化处理，65 ℃水浴30 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液于新的离心管中，加入上样缓冲液[80 mmol·L-1的Tris-HCl(pH=8.0)，20%甘油，0.069 mol·L-1SDS， 0.02%溴酚蓝染液]后上样。采用SDS不连续缓冲系统，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为10%，每孔上样5.5 μL,每板初始电压设置为100 V。染色液(10%冰醋酸，40%甲醇，0.05%考马斯亮蓝R250)染色约20 min，用脱色液(10%冰醋酸，40%甲醇)脱色约12 h，采用凝胶成像仪观察并拍照。

1.2.4 籽粒中不溶性蛋白聚合体含量(UPP) 测定

参照刘天红[12]的方法提取M6代种子的UPP；利用安捷伦HPLC色谱仪和Biosep-SEC-S3000排阻色谱柱(孔径300 Å，粒径3.5 mm，300 mm，7.8 mm)分析样品的蛋白质含量。以含0.05%三氟乙酸的50%(v/v)乙腈溶液为流动相进行冲洗，流速0.5 mL·min-1，冲洗30 min。采用手动积分获取各个组分的比值，UPP值为SDS-不溶性聚合体蛋白的面积占SDS-可溶性聚合体蛋白和SDS-不溶性聚合体蛋白面积之和的百分比。两次重复。

2 结果与分析

2.1 M6代EMS诱变系籽粒品质性状的变异

2.1.1 籽粒水分含量的变化

小麦籽粒内部复杂的生理生化过程都与其水分状态有关，淀粉和蛋白质等生物大分子的水合状态决定了淀粉合成途中关键酶的活性，从而影响淀粉的合成。由此可见，小麦籽粒的水分含量严重影响小麦产量及品质的形成[13]。西昌69的水分含量为11.52%，其M6代诱变系的水分含量平均为12.14%，最大值为14.48%，最小值为10.56%(图1A)。

2.1.2 籽粒粗蛋白含量的变化

小麦籽粒粗蛋白含量与面粉和面团的多个质量指标存在正相关关系，与面包烘焙品质存在显著正相关关系，是影响面包质量的决定因素[14-15]。西昌69的粗蛋白含量(干基)为16.37%，其M6代EMS诱变系的粗蛋白含量(干基)平均为 18.65%，最大值为24.55%，最小值为12.37%(图1B)。

2.1.3 籽粒湿面筋含量的变化

西昌69的湿面筋含量为34.20%，其M6代EMS诱变系的湿面筋含量平均为39.40%，最大值为 52.50%，最小值为24.83%(图1C)。

2.1.4 籽粒淀粉含量的变化

小麦籽粒中淀粉和蛋白质含量共同决定了小麦的加工品质[16]。小麦西昌69的淀粉含量为62.31%，其M6代EMS诱变系的淀粉含量平均为67.13%，最大值为79.97%，最小值为 52.34%(图1D)。

2.1.5 面团形成时间的变化

小麦面团的形成时间与面包外观存在显著负相关关系[14]。西昌69的形成时间为4.20 min，其M6代EMS诱变系的面团形成时间平均为 4.67 min，最大值为6.50 min，最小值为0.95 min(图1E)。

2.1.6 面团稳定时间的变化

小麦面团的稳定时间与面包膨胀度、面包体积存在显著正相关关系，但与面包外观存在显著的负相关关系[14]。小麦西昌69的稳定时间为13.40 min，其M6代EMS诱变系的面团稳定时间平均为16.40 min，最大值为32.55 min，最小值为 2.75 min(图1F)。

2.1.7 籽粒沉降值的变化

小麦沉降值是衡量小麦面筋数量和质量的间接综合指标，沉降值越大，表明面筋强度越大[17]。小麦西昌69的沉降值为40.22 mL，其M6代EMS诱变系的沉降值平均为47.09 mL，最大值为71.58 mL，最小值为25.21 mL(图1G)。

2.1.8 籽粒容重的变化

小麦容重对面粉的品质性状有一定影响[17]。小麦西昌69的容重为789.5 g·L-1，其M6代EMS诱变系的籽粒容重平均为775.1 g·L-1，最大值为834.5 g·L-1，最小值为726.5 g·L-1(图1H)。

A：水分含量；B：粗蛋白含量；C：湿面筋含量；D：淀粉含量；E：形成时间；F：稳定时间；G：沉降值；H：容重。

2.2 M6代千粒重的变化

小麦籽粒产量与其蛋白质含量一般呈负相关[18]，千粒重是影响产量的重要因素。小麦西昌69的千粒重为50.76 g，其M6代EMS诱变系的千粒重平均为46.02 g，最大值为60.83 g，最小值为26.23 g(图2)。

图2 西昌69 EMS诱变系M6代籽粒的千粒重

2.3 M6代籽粒中高分子量谷蛋白亚基的变异

SDS-PAGE结果(图3)表明，西昌69的高分子量麦谷蛋白亚基组成为1、17+18和2+12，对 1 667份M6代籽粒进行高分子量麦谷蛋白亚基鉴定和分析，与西昌69对比，发现101份高分子量麦谷蛋白亚基变异型材料，变异率为6.06%。在101份HMW-GS变异材料中，共鉴定出19种不同的HMW-GS组合类型，其中亚基缺失型3种，共16份变异材料；亚基置换型型8种，共34份变异材料；亚基缺失且发生置换8种，共27份变异材料；有24份变异材料出现了新型亚基，有待进一步研究。

图3 西昌69 EMS诱变系M6代籽粒HMW-GS的SDS-PAGE图谱

由表2可知，在Glu-A1位点上的变异主要表现为1亚基的缺失及1亚基变为2*亚基，其中1亚基缺失(null)出现频率最高，达30.69%。这与前人研究结果相似，即在Glu-A1位点上，null为优势亚基变异类型[19-22]。

表2 西昌69EMS诱变系的M6代籽粒HMW-GS变异分析

在Glu-B1位点上，HMW-GS的变异类型较为丰富，检测到7+8、7+9、14+15共3种类型，以7+8亚基出现频率最高(20.79%)，7+9亚基次之(14.85%)。这3种亚基组合与亲本的17+18亚基相比，并不优质[23]。造成这种现象的主要原因是EMS诱变是无方向性的，在部分材料品质提高的同时，可能会使部分材料的品质降低。

在Glu-D1位点上的变异，主要表现为2亚基或12亚基的缺失以及2+12亚基变为5+10亚基，其中5+10亚基变异频率最高(26.73%)。表明5+10亚基为西昌69的EMS诱变系在Glu-D1位点的主要变异形式。

2.3 M6代籽粒UPP值的变化

面粉的UPP含量与蛋白质、沉淀值等主要品质参数显著正相关，面粉的UPP值越大，小麦的综合质量越好[24]。在101份HMW-GS变异材料中，根据籽粒重要品质性状，如水分含量、粗蛋白含量、湿面筋含量、沉降值、形成时间、稳定时间等，筛选出35份优于亲本品质性状的变异材料，利用高效液相色谱技术，对其进行UPP值分析。结果发现，西昌69的UPP值为31.16%，35份诱变系材料的UPP值平均为35.88%，最小值为27.47%，最大值为45.84%，变异率为58.95%。其中，有7份材料(M1020、M1313、M1455、M1648、M1652、M1730、M1778)的UPP值略低于亲本，其余28份材料的UPP值均大于亲本(表3)。

比较35份筛选出的M6代籽粒的UPP值及千粒重(表3)，发现其UPP和千粒重均超过亲本的诱变系有：M636、M783、M1346、M1503，其余多个材料的千粒重与亲本相差无几；且大部分诱变系的UPP值大于亲本。有28份具有优于亲本籽粒品质性状且千粒重相对稳定的诱变系材料。

表3 35份优质西昌69 M6代EMS诱变系的千粒重及UPP

表1 EMS诱变西昌69的M6代籽粒HMW-GS组成类型

3 讨 论

目前,许多研究利用EMS诱变技术构建了突变体库，并在功能基因组学研究中发挥了重要作用[10]，但针对与小麦品质相关的贮藏蛋白变异的研究相对较少。本研究结果表明，西昌69的EMS诱变系M6代籽粒品质性状与亲本相比差异较大，其中，稳定时间的变异率最大。原因可能是稳定时间由多个位点控制[25]，诱变系的HMW-GS有丰富的变异类型。前人研究显示，EMS诱变易导致控制编码HMW-GS的基因发生沉默[26]，如徐艳花等[27]利用EMS诱变豫农201种子，发现其M2代突变体有21个缺失不同亚基的突变体，突变频率为2.26%。本研究中，在Glu-A1位点和Glu-D1位点均发生亚基的缺失，突变频率为2.28%，突变频率均较高。原因可能是EMS诱变导致DNA片段上出现单碱基的变化或缺失，进而表现为蛋白的缺失。一般来说，EMS诱变产生的HMW-GS不良变异较多，而优良变异较少[8]。本试验也获得了一些优质亚基组合，如1、17+18、5+10，null、17+18、5+10，null、17+18、2+12为变异材料中优质亚基类型，含有这些亚基的多个籽粒品质性状有所提高。这与前人关于17+18、5+10为优质亚基的结论相符[23,28]。另外，劣质亚基组合主要在Glu-B1位点产生，原因可能是EMS诱变在编码Glu-B1的基因中产生比其他基因更多的过早终止密码子，从而使蛋白组成发生改变[29]。在本研究中，还有部分诱变系出现了新型亚基，在闫 炯等[26]的研究中也出现了相似的结果，在Glu-B1和Glu-D1位点呈现出缺失和新增亚基2种情况。原因可能是经过EMS诱变处理以后，引起了基因的沉默和新基因的表达或引起麦谷蛋白结构基因的变异，从而导致小麦在蛋白水平上发生了变异[30]。本研究仅获得初步结果，关于新型高分子量谷蛋白亚基所产生的原因及其对小麦品质的影响还需进一步更深入研究。

小麦的粗蛋白含量、湿面筋含量、稳定时间及形成时间等籽粒品质性状与强筋小麦品质显著正相关[31]，UPP与小麦综合质量呈正相关关系[24]。本研究筛选出的28份较亲本UPP提高的诱变系，其各品质性状也优于亲本。在今后诱变材料的筛选中，UPP可以作为微量快速、鉴定及筛选优质诱变材料的指标。对于筛选出的28份品质提高的诱变系，我们将会在不同环境条件下种植，以检验其品质稳定性。