4份圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体的分子细胞遗传学鉴定

李洪雨，刘小娟，梁东玉，刘登才，郝 明，袁中伟，甯顺腙，张连全

(四川农业大学小麦研究所，四川成都 611130)

普通小麦驯化过程中经历了严重的进化瓶颈，导致遗传变异资源的丢失[1]。现代育种导致小麦遗传多样性进一步降低，遗传基础变得越来越狭窄[2]。因此，挖掘小麦属及其近缘属物种中优异的基因资源，并将其转入普通小麦显得尤为重要[1]。乌拉尔图小麦(T.urartu,AuAu,2n=2x=14)最早在1937年被发现[3]，它是四倍体小麦和六倍体小麦A基因组的供体[4]，易与小麦同源染色体发生联会和交换，并将其优异基因导入普通小麦基因组中。乌拉尔图小麦蛋白质含量较高，具有能改善小麦面粉加工品质的新型高分子量谷蛋白亚基和醇溶蛋白基因[5-7]，同时还具有早熟、抗旱、抗病、抗逆等优异性状[3,8-10]，将这些基因或优异性状异入普通小麦有利于普通小麦的遗传改良。

乌拉尔图小麦遗传物质向普通小麦转移的途径主要有两种：一是乌拉尔图小麦与普通小麦直接杂交[11-12]；二是以硬粒小麦-乌拉尔图小麦双二倍体为“桥梁”进行转移[13-14]。2014-2015年本课题组利用中国的3个四倍体小麦地方品种圆锥小麦为母本，国外引进的4个乌拉尔图小麦为父本进行杂交，获得杂种F1，然后利用0.1%秋水仙素溶液进行加倍处理，成功获得了4份圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体。本研究拟对这4份新合成的双二倍体的染色体组成、农艺性状及高分子量谷蛋白亚基组成进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材 料

植物材料，包括普通小麦SY95-71和4份圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体(Syn-TAU-1、Syn-TAU-2、Syn-TAU-3和Syn-TAU-4)及其亲本圆锥小麦和乌拉尔图小麦(表1)。圆锥小麦(T.turgidumL. ssp.turgidum)AS2313、AS2380和AS2382均是中国四倍体小麦地方品种；乌拉尔图小麦TA#831来自于伊朗，PI428224来自于土耳其，PI428270和PI428274来自于黎巴嫩。双二倍体是以圆锥小麦为母本与乌拉尔图小麦为父本进行远缘杂交，杂种F1植株通过0.1%秋水仙素溶液加倍处理获得S1代。其中PI编号的材料由美国国家种质资源库 (http://www.ars-grin.gov)提供，其他材料均由四川农业大学小麦研究所提供。条锈病混合菌种(条种31、条种32、条种33、条种34和水源11-4生理小种)由甘肃省农业科学院植物保护研究所提供。

1.2 农艺性状调查

小麦成熟期，随机选取每个材料的10个单株进行株高(株高是地面到穗顶部之间除去芒的高度)、分蘖数、穗长、每穗小穗数(不包括无效小穗)、穗粒数(第一和第二小花的结实粒数)和自交结实率等性状的测量。自交结实率=穗粒数/(2×总小穗数)× 100%。利用Excel 2010软件进行数据处理。

1.3 条锈病鉴定

所有材料均种植于四川农业大学温江实验基地。成株期的条锈病抗性田间鉴定在2015-2016年小麦生长季节进行。实验材料行距30 cm，行长1 m，株距10 cm，诱发材料SY95-71种植于实验行的两侧，用于条锈病的接种和诱发。在小麦成株期，使用条锈菌混合菌种(条中31、条中32、条中33、条中34和水源11-4生理小种)进行田间接种。在诱发材料充分发病时，调查每个材料旗叶和倒二叶的发病程度(反应型)，每隔 10 d调查一次，调查三次，反应型参照Wellings等[15]的标准划分为1～9级(1～2为高抗，3为抗病，4为中抗，5为中间型，6～7为中感，8为感病，9为高感)。

1.4 细胞学观察

根尖体细胞及花粉母细胞染色体数目的观察参照Zhang等[16]的方法。荧光原位杂交操作参照Tang等[17]和Zhao等[18]的方法，寡核苷酸序列探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1、Oligo-pTa71-2、pTa-713及简单重复序列探针(AAC)5由成都擎科公司合成(中国，成都)。使用奥林巴斯BX63荧光显微镜进行杂交信号检测，奥林巴斯DP70 CCD相机进行图像采集。A和Au基因组染色体的鉴定参照Badaeva等[19]、Zeng等[20]、Li等[21]的方法，B基因组染色体的鉴定参照Li等[21]的方法。对双二倍体的花粉母细胞减数分裂中期I染色体进行观察时，选择50个细胞统计单价体(I)、二价体(II)、三价体(III)和四价体(IV)的个数并计算平均数。

1.5 SDS-PAGE分析

种子高分子量谷蛋白的提取和SDS-PAGE分析参照 Yan等[22]的方法。标准高分子量谷蛋白亚基对照为川育12 (1，7+8，5+10)，中国春(null，7+8，2+12)和龙辐麦1号(2*，7+8，5+10)，每份圆锥小麦-乌拉尔小麦双二倍体均选择5粒种子进行分析。

2 结果与分析

2.1 双二倍体农艺性状及条锈病成株抗性

新合成的圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体植株生长旺盛 (图1a)，穗子变长 (图1b)。4份双二倍体的株高介于108.45～129.43 cm，分蘖数介于7.3～17.5个，穗长介于10.23～12.17 cm，小穗数介于16.26～22.06个，自交结实率介于37.77%～70.46%(表1)。在成株期，4份双二倍体与诱发材料SY95-71相比，均高抗条锈病(表1和图2)。前期的观察结果表明，4份双二倍体的亲本中，除乌拉尔图小麦PI428274高感条锈病外，其他3份乌拉尔图小麦均抗条锈病，而3份圆锥小麦均高抗条锈病，因此双二倍体Syn-TAU-1、Syn-TAU-2和Syn-TAU-3中的条锈病抗性无法确定是来自圆锥小麦还是乌拉尔图小麦，只有Syn-TAU-4的条锈病抗性确定来自圆锥小麦。

a：普通小麦 SY95-71；b：Syn-TAU-1；c：Syn-TAU-2；d：Syn-TAU-3；e：Syn-TAU-4。

表1 圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体的农艺性状及条锈病抗性

a、b：从左到右依次为双二倍体Syn-TAU-1的亲本圆锥小麦AS2313、Syn-TAU-1及亲本乌拉尔图小麦PI428224。

2.2 双二倍体的染色体观察

4份圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体的根尖体细胞染色体数目观察结果表明，28株植株中有24株染色体数目为42条，3株植株染色体数目为41条，1株植株染色体数目为40条(表2)。利用寡核苷酸序列探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa71-2、Oligo-pTa535-1、pTa-713和(AAC)5对42条染色体的植株进行了多色FISH鉴定。

红色标记的探针Oligo-pSc119.2-1在B基因组所有染色体上均有很强的荧光信号，在A基因组的染色体4A长臂的端部有较强的荧光信号。黄色标记的探针Oligo-pTa71-2在1BS和6BS染色体的亚端部区有很强的荧光信号(图3)。绿色标记的探针Oligo-pTa535-1、红色标记的探针pTa-713和绿色标记的重复序列探针(AAC)5结合可以用来区分Au和A基因组的所有染色体(图3)。探针Oligo-pTa535-1在A和Au基因组的所有染色体上都有荧光信号，但在染色体3A与3Au、4A与4Au上的荧光信号不同。探针pTa-713在染色体1A和1Au上荧光信号不同，在染色体1A的近着丝粒区域有荧光信号，而在染色体1Au的长臂亚端部有荧光信号；在染色体5A和6A短臂的端部有荧光信号，而在染色体5Au和6Au上没有荧光信号。重复序列探针(AAC)5在染色体7A和7Au上荧光信号不同(图3a)，在染色体7A和7Au的着丝粒位置均有荧光信号，但在染色体7Au上的荧光信号更强，且在长臂上有较弱的信号；在2A染色体短臂近着丝粒区有很强的荧光信号，但在2Au染色体上没有信号。因此，Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa71-2、Oligo-pTa535-1、pTa-713和(AAC)5这五个探针结合可以用来区分圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体的42条染色体(图3a)。

a图为Syn-TAU-1及其亲本A、B和Au染色体组的FISH核型图；b、c、d图依次为Syn-TAU-1、PI428224(T.urartu )、AS2313(T.turgidum ssp.turgidum )的FISH鉴定；寡核苷酸序列探针为Oligo-pSc119.2-1 (红色),Oligo-pTa535-1 (绿色),Oligo-pTa71-2 (黄色),pTa-713 (红色) 和(AAC)5 (绿色)。

对染色体数为42条的双二倍体植株进行花粉母细胞减数分裂中期I观察，结果表明，42条染色体大多配对成二价体(85.09%～97.10%)，存在少量的单价体(1.00%～2.60%)、三价体(0.40%～ 10.00%)和四价体(0.00～3.40%)(图4，表2)，这些多价体的存在说明A和Au染色体发生了配对。

a：Syn-TAU-1，具有 18个二价体、1个四价体和2个单价体；b：Syn-TAU-2，具有 20个二价体、1个三价体和1个单价体；c：Syn-TAU-3，具有 17个二价体和2个四价体；d：Syn-TAU-4，具有 17个二价体、1个三价体、1个四价体和1个单价体。短箭头、三角箭头和长箭头分别指示单价体、三价体和四价体。

表2 圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体染色体构型

2.3 SDS-PAGE 分析

已有研究表明[23]，PI428224的高分子量谷蛋白亚基组成为Glu-Au1-II(图5，泳道1)，TA# 831的高分子量谷蛋白亚基组成为Glu-Au1-III(图5，泳道4)，PI428270和PI428274高分子量谷蛋白亚基组成为Glu-Au1-VII(图5，泳道7和10)。其中，2份乌拉尔图小麦PI428224和TA#831的1Ax亚基的迁移率均与1Ax2*相同，而四倍体小麦AS2313的亚基为1Ax2*，所以无法确定双二倍体Syn-TAU-1和Syn-TAU-2的1Ax亚基是来自亲本乌拉尔图小麦还是四倍体小麦(图5，泳道2和泳道5)。除PI428224的1Ay亚基不表达外，其他3份乌拉尔图小麦的1Ay亚基均能表达，但其迁移率均慢于中国春的亚基1Dy12。其中，来自于TA#831的1Ay亚基在双二倍体Syn-TAU-2中得到了表达，但在双二倍体中其迁移率发生了变化(图5，泳道5)；来自于PI428270和PI428274的1Ax和1Ay亚基分别在双二倍体Syn-TAU-3和Syn-TAU-4中得到了表达(图5，泳道8和泳道11)。

CS：中国春；CY12：川育12；LM1：龙辐麦1号；1:PI428224;2:Syn-TAU-1;3:AS2313;4:TA#831;5:Syn-TAU-2;6:AS2313;7:PI428270;8:Syn-TAU-3;9:AS2380;10:PI428274;11:Syn-TAU-4;12:AS2382. 黑色箭头指示乌拉尔图小麦的1Ax亚基，白色箭头指示乌拉尔图小麦的1Ay亚基，绿色箭头指示在合成双二倍体中迁移率发生了变化的来自乌拉尔图小麦的1Ay亚基。

3 讨 论

乌拉尔图小麦具有丰富的未被开发利用的遗传多样性[13]。虽然与普通小麦直接杂交可以导入乌拉尔图小麦的优异基因，但是该方式存在一定的局限性，比如普通小麦与乌拉尔图小麦杂交不能正常结实，必须通过幼胚拯救才能获得杂种苗，杂种F1自交高度不育，回交结实率很低[11]。研究表明，人工合成的双二倍体不但是检测和转移新性状的永久资源，而且经改良也可以成为新物种[24]。硬粒小麦-乌拉尔图小麦双二倍体已被成功合成[13-14]，通过种内杂交丰富了二倍体乌拉尔图小麦的多样性，为小麦育种提供了兼聚硬粒小麦和二倍体祖先抗性基因的独特方法[21]。本课题组前期获得的4份圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体不同于前人获得的硬粒小麦-乌拉尔图小麦双二倍体，为小麦育种提供了新的资源。

条锈病是严重影响全球小麦产量的病害之一。新的条锈菌生理小种CYR34 (V26)的出现和流行使得中国许多小麦品种丧失了抗性，因此，种植新的抗性种质资源[25]是防治条锈病最经济有效的措施。本课题组前期获得的4份新合成双二倍体在成株期均对中国小麦条锈菌当前流行小种表现高抗。由于亲本圆锥小麦AS2313、AS2380和AS2382均高抗条锈病，因此我们无法确定来自于乌拉尔图小麦的抗性基因是否在双二倍体Syn-TAU-1、Syn-TAU-2和Syn-TAU-3中正常表达。这些新合成的双二倍体是普通小麦育种改良的新的条锈病抗性资源。

HMW-GSs是麦谷蛋白聚合物的组成部分，在决定小麦面团独特的粘弹性方面起着关键作用[5]。乌拉尔图小麦是普通小麦品质改良的新的种质资源[9-11,26]。在普通小麦中，lAx不经常表达，1Ay根本不表达[5,7]。本研究中，来自于乌拉尔图小麦TA#831的1Ay亚基在双二倍体Syn-TAU-2中得到了表达，但在双二倍体中其分子量发生了变化；来自于PI428270和PI428274的1Ax和1Ay亚基分别在双二倍体Syn-TAU-3和Syn-TAU-4中得到了表达。这些双二倍体在普通小麦品质改良中的作用还有待进一步研究。

Au和A基因组染色体发生配对和重组是四倍体小麦-乌拉尔图小麦双二倍体向普通小麦转移基因所必需的。已有研究表明，四倍体小麦和乌拉尔图小麦杂种F1的染色体可以配对成7个二价体和7个单价体[27]，而普通小麦/乌拉尔图小麦杂种F1每个花粉母细胞染色体平均配对成4.94个二价体和0.01个三价体[28]。本研究中，圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体的染色体在减数分裂中期I配对时有少量多价体形成，为将乌拉尔图小麦的优异基因通过双二倍体作为“桥梁”转入普通小麦提供了可能。

荧光原位杂交(FISH)可用来鉴别乌拉尔图小麦的Au基因组及四倍体小麦A、B基因组[19-21]。本研究结合利用寡核苷酸序列探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1、Oligo-pTa71-2、pTa-713和简单重复序列探针(AAC)5成功将圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体中的42条染色体区分开，这些探针可进一步作为细胞学标记用于圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体育种改良工作中。

本研究我们对前期所创制的4份圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体进行了细胞遗传学鉴定，下一步将利用这些双二倍体材料与普通小麦品种进行杂交和回交，进一步将双二倍体携带的优异性状转移到普通小麦中，促进小麦育种改良。