气相色谱-质谱联用检测分析六大蒸馏酒中挥发性成分差异

宋丹丹，何鹏辉，陈 娟，杨 亮

（1.茅台学院 酿酒工程系，贵州 仁怀 564501；2.湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉 430062；3.茅台学院 食品工程系，贵州 仁怀 564501）

含酒精饮料是人类文明的一部分。在文明的发展过程中，世界各地出现了多种蒸馏酒，它们在发展过程中形成了自己独特的酿酒工艺。现普遍认为世界蒸馏酒有六种代表性产品，包括以高粱、小麦等谷物为原料的中国白酒[1]；以葡萄或其他水果为原料的白兰地[2]；以谷物及大麦芽为原料的威士忌[3]；以甘蔗或糖蜜为原料的朗姆酒[4]；以粮谷和薯类为原料经发酵、蒸馏得到的食用酒精为原料的伏特加[5]和以粮谷为原料经发酵、蒸馏得到食用酒精串香杜松子的金酒[6]。六大蒸馏酒各有独特的风格，这些酒的风格特征和品质取决于其挥发性香味物质的成分、含量及其量比关系[7-8]。

由于使用不同的原料、生产工艺和贮存条件，这些蒸馏酒中的化合物可能有所不同。如大多数西方蒸馏酒用纯种酵母发酵，而中国白酒的发酵是由多种微生物（细菌、酵母、丝状真菌等）共同完成的[9-11]。此外，中国白酒是通过固态酿造，而西方蒸馏酒则是液态酿造。因此，中国白酒和西方白酒在成分特征方面具有较大差异[12]。

本研究利用气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）技术对6种蒸馏酒（中国白酒（酱香型）、威士忌、白兰地、伏特加、朗姆酒和金酒））中的挥发性物质进行了分离和鉴定，在主成分分析（principal component analysis，PCA）的基础上，进一步分析比较6种蒸馏酒间挥发性物质差异，比较了不同蒸馏酒中化学成分，对充分认识蒸馏酒风格的实质具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无水硫酸钠、丙酮（均为分析纯）：国药集团上海化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：美国Thermo Fisher Scientific公司；6种蒸馏酒酒样（S1中国白酒，酒精度43%vol；S2威士忌，酒精度40%vol；S3白兰地，酒精度40%vol；S4伏特加，酒精度40%vol；S5朗姆酒，酒精度40%vol；S6金酒，酒精度40%vol）：市售。

1.2 仪器与设备

ME204E万分之一天平：瑞士梅特勒-托利多国际有限公司；Trace1300气相色谱-TSQ8000质谱联用仪（AI1310自动进样器）：美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 酒样前处理

将实验酒样样本各取3份，每份2 mL，加入2 g无水硫酸钠，混匀，4 ℃静置24 h；随后4 ℃、14 000 r/min离心5 min；取800 μL上清液使用0.22 μm有机滤膜过滤至气相瓶中；采用GC-MS检测。

1.3.2 色谱与质谱检测条件

气相色谱参数如下：色谱柱TG-WAXMS（0.25 μm，30 m×0.25 mm）；进样口温度250 ℃，进样量1 μL，载气为氦气（N2），流速1.2 mL/min，采用不分流进样；升温程序为初始温度50 ℃保持1 min，6 ℃/min升至230 ℃，保持15 min，分析时间为45 min。

质谱参数如下：全扫模式，离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，传输线温度230 ℃，离子源温度250 ℃，扫描范围为35～600 m/z，溶剂滞留时间5 min。

1.3.3 定性和定量分析方法

定性分析方法：将经过分析得到的气相色谱图与质谱离子碎片图谱和美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库中的标准图谱进行比对，正反匹配率＞800的表示定性准确。

定量分析方法：利用气相色谱与质谱联用仪自带数据处理软件TraceFinder 4.1进行峰提取和峰对齐，利用特征峰对每个物质进行定量分析，采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

1.3.4 数据处理

实验数据采用TraceFinder 4.1进行峰提取和峰对齐操作，计算每个物质的相对含量；利用SIMCA 14进行主成分统计分析和差异分析；利用Microsoft Excel 2016和SPSS 17.0进行数据处理并计算P值，P＜0.05为差异显著。每种酒样3个平行。

2 结果与分析

2.1 不同酒样中挥发性物质主成分聚类分析

不同来源酒样中的挥发性物质经GC-MS检测后的总离子流色谱图如图1所示，由于溶剂峰较高，容易干扰检测线，因此从第5分钟开始监测挥发性物质的出峰情况。

图1 6种不同酒样中挥发性物质GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ions chromatogram of volatile compounds in six different spirits samples analysis by GC-MS

从图1可知，中国白酒（酱香型）的挥发性物质种类比其他酒样要多，且物质出峰的离子强度远高于其他酒样。其次是白兰地，挥发性物质种类也比较多，高于威士忌、伏特加、朗姆酒和金酒。6种酒样中一共有85种物质被检测到，与NIST数据库进行比对分析后，有79种物质能够被精确定性。将6种酒样中被定性出的挥发性物质进行组成种类分析，结果见图2。由图2可知，中国白酒（酱香型）中酯类物质、酸类物质和醇类物质的种类均高于其他酒样，这也是中国白酒（酱香型）比其他种类酒的香味更浓、更醇厚的原因之一[7]；另外，中国白酒（酱香型）中的酮类物质种类相对较少，而威士忌、白兰地和伏特加中的酮类物质较多。酒样中酮类物质大多是呋喃酮及其衍生物，其中呋喃酮具有浓郁的香味，且阈值较低，对酒体风味具有重要贡献[13-14]。虽然中国白酒（酱香型）中酮类物质较少，但中国白酒（酱香型）中的乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）的含量相对较高，赋予白酒奶油香味[15-16]。酮类物质及种类的差异也是造成西方蒸馏酒与中国白酒（酱香型）风味差异的主要因素。其次，中国白酒（酱香型）中的呋喃类化合物种类明显高于其他酒，呋喃类化合物给酒体带来温和香味[17-19]；朗姆酒和金酒的挥发性成分较少，且含量较低，酸类物质占比较大，这可能是朗姆酒和金酒较为辛辣的原因之一。由于这些挥发性物质种类的差异，造成了中国白酒（酱香型）与其他蒸馏酒风味上的差异。中国白酒（酱香型）中还含有其他酒均不存在的吡嗪类物质[20-21]。在中国白酒（酱香型）的酿造过程中，芽胞杆菌代谢生成的乙偶姻在高温条件下会自发形成四甲基吡嗪及其衍生物[22]。

图2 不同酒样中挥发性物质组成差异Fig.2 Differences in volatile compounds between different spirits samples

主成分分析（principal component analysis，PCA）是考察多个变量间相关性的一种行之有效的多元统计方法。本研究采用SIMCA 14对酒样进行主成分分析，结果如图3A所示。将六种酒的挥发性成分进行统计分析后，样品S1（中国白酒）与样品S3（白兰地）差异明显，S2（威士忌）、S4（伏特加）、S5（朗姆酒）和S6（金酒）无明显差异，但与S1和S3差异明显。

进一步将S1和S3单独进行差异分析，结果如图3B所示，样品S1和S3有很明显差异。将没有明显差异的样品S2、S4、S5和S6进行主成分分析，结果（图3C）显示，样品S2与S4，S5、S6均具有明显差异，S5和S6没有明显差异，进一步将S5和S6进行分析，S5和S6有明显差异（图3D）。

图3 不同酒样中挥发性物质主成分分析Fig.3 Principal components analysis of volatile compounds in different spirits samples

结合图2和图3分析，可发现样品S1和S3之间的显著差异主要是由于物质含量上的差异造成的，而并非由于挥发性成分的组成结构，S2和S4、S5和S6亦是如此。但是样品S1、S3和样品S2、S4、S5、S6之间的差异则主要是由于挥发性物质种类差异造成的，样品S1和S3、S2和S4、S5和S6种类相差不大，说明六种酒中挥发性物质的差异不仅与挥发性成分的种类相关，而且与挥发性物质成分的含量有关。

2.2 不同来源酒样中挥发性物质差异分析

将5种西方蒸馏酒作为一类样品，与中国白酒（酱香型）中的挥发性物质进行比较，结果如图4、图5及表1所示。中国白酒（酱香型）与西方蒸馏酒在挥发性物质种类上有明显的差异，其中有27种挥发性物质是相同的，同时中国白酒（酱香型）有29种特有的物质，而西方蒸馏酒中有22种特有的物质。

图4 酱香型白酒和西方蒸馏酒在挥发性成分种类上的异同Fig.4 Similarities and differences in types of volatile components of sauce-flavor Baijiu and western distilled spirits

对于醇类物质，西方蒸馏酒中的高级醇种类明显多于中国白酒（酱香型），特别是含有10碳的芳樟醇和4-萜烯醇。芳樟醇和4-萜烯醇都是萜烯醇类化合物，其中芳樟醇气味纯正清甜，能赋予蒸馏酒花香、水果香等风味[23]；4-萜烯醇则赋予蒸馏酒较淡的土香和木香[24]。芳樟醇和4-萜烯醇在西方蒸馏酒挥发性醇类成分中所占比例较大，其中金酒中的醇类成分仅有这两种醇，是金酒风味的主要贡献者。此外，具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香等气味的苯乙醇[25-26]，它在中国白酒（酱香型）、威士忌、白兰地、伏特加和朗姆酒等酒中都存在，是重要的香气成分，且中国白酒（酱香型）中的苯乙醇含量远高于其他蒸馏酒（表1）。

其次，六大蒸馏酒的酸类物质差异较大。中国白酒（酱香型）中酸类物质的种类与含量均高于西方蒸馏酒，其中乙酸是所有酒中含量和占比最大的酸类化合物，中国白酒（酱香型）和白兰地酒样中乙酸含量较为接近，且均高于其他酒样；另外，由图5和表1可以看出，中国白酒（酱香型）中6碳以下的低级脂肪酸占比较高，而西方蒸馏酒中6碳以上的高级脂肪酸占比较高。

中国白酒（酱香型）与西方蒸馏酒的另一大类物质区别是酯类物质，酸和醇在发酵过程中经生化反应形成了各种酯类，其中乙酯是酒中酯类的主体成分，脂肪酸乙酯无论从数量上还是种类上都占绝大多数。含碳数在10以下的脂肪酸乙酯有香气，12个碳以上的高级脂肪酸乙酯几乎无气味[27-28]。中国白酒（酱香型）中乳酸乙酯和棕榈酸乙酯占酯类物质的大部分，而这两种酯类化合物在西方蒸馏酒几乎检测不到。另外，西方蒸馏酒样中10碳以下的脂肪酸酯含量较多，而中国白酒（酱香型）中的棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯等高级脂肪酸含量较高，这也是西方蒸馏酒和中国白酒（酱香型）风味差异的主要原因之一。

图5 酱香型白酒和西方蒸馏酒在挥发性成分含量上的差异Fig.5 Differences in of contents of volatile components of sauce-flavor Baijiu and western distilled spirits

表1 酱香型白酒和西方蒸馏酒挥发性物质含量的差异分析Table 1 Analysis of the differences in volatile matter contents between sauce-flavor Baijiu and western distilled spirits

续表

图6 酱香型白酒挥发性物质含量测定Fig.6 Determination of volatile compound contents in sauce-flavor Baijiu

羰基化合物是另一大类在六大蒸馏酒挥发性成分差异较大的物质。西方蒸馏酒中酮类化合物的种类数量远远高于中国白酒（酱香型）（如图2和图4所示）。虽然本研究只在中国白酒（酱香型）中检出一种酮类物质，但其含量与白兰地中总酮类物质含量接近，且远高于其他蒸馏酒（P＜0.01）。酮类化合物含量，在中国白酒（酱香型）挥发性物质中所占比例低于西方蒸馏酒，因此在酒的风味中酮类物质对西方蒸馏酒的贡献可能大于中国白酒（酱香型）。由图6可知，对于醛类化合物，中国白酒（酱香型）的糠醛含量很高，其含量仅次于乳酸乙酯和2,3-丁二醇。糠醛是中国白酒中重要的风味物质，其含量越高，酒味越香醇[29]，特别是中国酱香型白酒独特的高温发酵工艺，促进了糠醛的生成。另外，苯甲醛只在中国白酒（酱香型）中检出，苯甲醛是最简单的芳香醛，赋予中国白酒（酱香型）杏仁香气[30]。而5-羟甲基糠醛和香草醛只在西方蒸馏酒中检出，其中5-羟甲基糠醛存在于威士忌、白兰地、伏特加和朗姆酒中，且白兰地中含量最高[31]；香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）仅在白兰地中检测出来，是在其陈酿过程中由橡木桶溶出，赋予酒体独特的香气[32-33]。

对于呋喃类化合物，2-乙酰呋喃仅存在于中国白酒（酱香型）中，2-乙酰呋喃具有杏仁、坚果、酵香、牛奶和焦糖香[18]，是中国白酒（酱香型）重要的风味物质之一。而2,5-二甲醛呋喃在六大蒸馏酒中均存在，在白兰地中含量最高（见表1），目前尚未见2,5-二甲醛呋喃在气味上的报道。

3 结论

本研究为了更好的保留酒样中的成分，采取了除水后直接进样的方式对酒样中的挥发性成分进行了检测，在强极性色谱柱TG-WAXMS的分离下，在六大蒸馏酒中一共检测到了85种物质，其中有79种被精确定性。主成分分析（PCA）结果显示，六大蒸馏酒之间的挥发性物质的种类和含量均具有显著差异，进一步进行差异分析发现，相比于西方蒸馏酒，中国白酒（酱香型）的香味成分具有酸高、酯高、醛酮高、高级醇低等特征。

对六大蒸馏酒的挥发性物质种类进行统计分析，中国白酒（酱香型）与西方蒸馏酒在挥发性物质种类上有明显差异，其中29种物质只在中国白酒（酱香型）中检出，而有22种物质只在西方蒸馏酒中检出。中国白酒（酱香型）与西方蒸馏酒在风格上的极大差异可能受到许多因素影响，包括原材料、生产工艺、微生物和不同贮存容器，也正是由于这些差异造就了不同的酒体风格。对中国白酒（酱香型）和西方蒸馏酒在挥发性物质上的差异研究，有助于深入了解六大蒸馏酒的挥发性物质差异，为酒体的质量评估奠定基础。