半乳糖凝集素- 9和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3在口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

王辉，张利娟，杨芳

1青岛大学口腔医学院，山东 青岛266071

2青岛市市立医院口腔医疗中心，山东青岛266071

口腔扁平苔藓是一种常见的炎性口腔黏膜疾病，多发生于中年女性，临床表现为小丘疹连成条状白色或花白色纹路，多呈对称性分布，严重者病损区还伴有萎缩糜烂的现象。临床研究显示，糜烂型口腔扁平苔藓约有0.5%的癌变率，因此，将口腔扁平苔藓定义为癌前状态[1]。据报道，T细胞介导的免疫功能障碍与口腔扁平苔藓的发生发展密切相关[2]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T‐cell immunoglobulin mucin family member 3，TIM3）是辅助性T细胞（helper T cell，Th）1/Th2的特异性表面标志，半乳糖凝集素‐9（Galectin‐9）是TIM3的配体，研究发现TIM3/Galectin‐9途径在机体免疫调节、逃逸及耐受中具有重要作用[3]。目前有关TIM3表达与口腔鳞状细胞癌关系的报道较多[4‐5]，但有关Galectin‐9和TIM3在口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌中表达情况的相关研究较少。本研究分析Galectin‐9和TIM3在口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌中的表达情况及与患者临床特征的关系，旨在探索口腔扁平苔藓向口腔鳞状细胞癌发展的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年9月至2018年9月青岛市市立医院收治的口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌患者。纳入标准：①通过临床表现和病理检查首次确诊为口腔扁平苔藓或口腔鳞状细胞癌；②病理组织标本保存完整。排除标准：①合并其他口腔黏膜疾病；②合并重要器官（心、肝、肾等）功能障碍；③合并其他肿瘤；④具有先天性免疫疾病；⑤月经期、妊娠期或哺乳期女性；⑥使用过抗生素、皮质激素和免疫相关药物。依据纳入和排除标准，本研究共纳入42例口腔扁平苔藓患者和25例口腔鳞状细胞癌患者，分别作为口腔扁平苔藓组和口腔鳞状细胞癌组。另选择30例口腔黏膜正常者（因外伤或美容需要行口内黏膜手术）作为对照组。口腔扁平苔藓组中，男16例，女26例；年龄21～65岁，平均年龄（48.51±15.49）岁；病理类型：糜烂型20例，非糜烂型22例。口腔鳞状细胞癌组中，男10例，女15例；年龄42～74岁，平均年龄（51.37±14.56）岁；分化程度：高分化6例，中分化9例，低分化10例；有淋巴结转移11例，无淋巴结转移14例。对照组中，男12例，女18例；年龄25～60岁，平均年龄（49.82±12.47）岁。3组研究对象的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组织化学染色方法

将组织蜡块切成4 μm薄片，置于60℃烤箱中烘烤1 h，滴加二甲苯（完全覆盖组织切片）进行脱蜡，依次放入梯度乙醇中水化，然后将组织切片放入柠檬酸盐缓冲液中，高温加热2 min，修复抗原；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后滴加3%过氧化氢，孵育10 min，阻断内源性过氧化氢酶的活性；PBS清洗后加入PV‐9000试剂盒中的山羊血清，室温孵育30 min，封闭非特异性位点；滴加稀释后的一抗（Galectin‐9和TIM3的稀释比例均为1∶100），4℃孵育过夜；PBS清洗后滴加试剂盒中的二抗，37℃孵育30 min；PBS清洗后滴加试剂盒中辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育15 min；PBS清洗后滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液进行显色，待显微镜下观察到明显阳性染色而背景色较浅时终止显色；将组织置于苏木素中复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.3 免疫组织化学染色结果判断标准

由2名资深病理医师采用双盲法[6]阅片，判断各切片的染色情况，光镜下Galectin‐9和TIM3均定位于细胞质或细胞核，阳性表达呈棕黄色或淡黄色颗粒。依据染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，褐色为3分。依据阳性细胞比例评分：≤10%为0分，11%～30%为1分，31%～70%为2分，＞70%为3分。染色强度评分与阳性细胞比例评分相加，0～1分为阴性表达，≥2分为阳性表达[7]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK‐q检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同类型口腔组织中Galectin- 9和TIM 3表达情况的比较

Galectin‐9和TIM3在口腔细胞中的阳性表达主要位于细胞质或细胞核。正常口腔黏膜组织、口腔扁平苔藓组织及口腔鳞状细胞癌组织中Ga‐lectin‐9和TIM3的表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。口腔鳞状细胞癌组织中Galectin‐9的阳性表达率低于口腔扁平苔藓组织和正常口腔黏膜组织，TIM3的阳性表达率高于正常口腔黏膜组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；口腔扁平苔藓组织中Galectin‐9的阳性表达率低于正常口腔黏膜组织，TIM3的阳性表达率高于正常口腔黏膜组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 3种口腔组织中Galectin‐ 9和TIM 3表达情况的比较[ n（%）]

2.2 不同临床特征口腔扁平苔藓患者口腔扁平苔藓组织中Galectin- 9和TIM 3表达情况的比较

不同年龄、性别口腔扁平苔藓患者口腔扁平苔藓组织中Galectin‐9和TIM3的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。糜烂型口腔扁平苔藓患者口腔扁平苔藓组织中Galectin‐9的阳性表达率低于非糜烂型口腔扁平苔藓患者，TIM3的阳性表达率高于非糜烂型口腔扁平苔藓患者，差异均有统计学意义（χ2=6.988、4.400，P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征口腔扁平苔藓患者口腔扁平苔藓组织中Galectin‐ 9和TIM 3的表达情况（ n=42）

2.3 不同临床特征口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中Galectin- 9和TIM 3表达情况的比较

不同年龄、性别口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中Galectin‐9的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同年龄、性别、淋巴结转移情况口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中TIM3的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同分化程度、淋巴结转移情况口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中Galectin‐9的表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=8.796、6.173，P＜0.05）；不同分化程度口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中TIM3的表达情况比较，差异有统计学意义（χ2=6.884，P＜0.05）。（表3）

2.4 口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌患者中Galectin- 9和TIM 3表达的相关性

Pearson相关分析结果显示，口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌患者中Galectin‐9和TIM3的表达均呈负相关（r=-0.415、-0.437，P＜0.01）。

表3 不同临床特征口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中Galectin‐ 9和TIM 3的表达情况（ n=25）

3 讨论

目前，口腔扁平苔藓的发病机制尚不明确，但文献显示，口腔扁平苔藓患者病损处、唾液及组织渗出液等均表现出Th1/Th2的失衡[8‐9]，提示Th1/Th2可能通过抑制机体的细胞免疫应答，参与口腔扁平苔藓的发生发展。TIM3基因可特异性表达于Th1细胞表面，直接参与T细胞的免疫应答，TIM3还可表达于其他免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，介导炎性反应而发挥促炎作用[10]。丁思思等[11]研究发现，TIM3在类风湿性关节炎患者血清和关节滑液中的表达水平显著高于健康者，提示高表达的TIM3可抑制机体细胞免疫功能，从而参与自身免疫性疾病的发生发展。Deng等[12]研究发现，抑制TIM3的表达可以抑制肿瘤的发生发展。上述文献均表明，TIM3在多种免疫性疾病和恶性肿瘤中发挥作用。本研究结果显示，TIM3在正常口腔黏膜组织、口腔扁平苔藓组织及口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率逐渐升高，提示TIM3在扁平苔藓病损形成及癌变过程中具有重要作用，可能是由于TIM3介导免疫应答导致扁平苔藓炎症反应迁延反复。本研究结果还显示，TIM3在糜烂型口腔扁平苔藓患者、中‐低分化口腔鳞状细胞癌患者中的阳性表达率较高，进一步表明TIM3可能参与口腔黏膜的早期癌变过程。

Gaectin‐9是TIM3的配体，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞中，参与调节细胞分化、凋亡、黏附、聚集及炎性反应[13]。研究显示，Galectin‐9结合TIM3后可以选择性地清除抗原特异性Th1细胞，诱导其凋亡，终止Th1细胞的免疫功能，提示TIM3/Galectin‐9途径可控制Th1细胞的数量及功能[14]。方政等[15]研究发现，Galectin‐9可通过介导免疫应答抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭，并诱导其凋亡。本研究发现，Galectin‐9在正常口腔黏膜组织、口腔扁平苔藓组织及口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率逐渐降低，推测口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌患者中Galectin‐9表达水平较低，无法清除大量活化的Th1细胞，从而引起病理损伤。同时，Galectin‐9在糜烂型扁平苔藓患者和低分化、有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌患者中的阳性表达率较低，提示Galectin‐9可能在口腔黏膜早期癌变过程中具有重要作用。Pearson相关分析结果显示，口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌患者中Galectin‐9和TIM3的表达均呈负相关（P＜0.01），进一步验证了上述TIM3/Galectin‐9途径的作用。

综上所述，口腔扁平苔藓的发生发展涉及多因素、多分子的共同作用，TIM3/Galectin‐9途径在多种Th1表达异常的疾病中均存在异常。Galectin‐9和TIM3可能参与口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌的发生发展，并可能与口腔扁平苔藓的癌变有关，但TIM3、Galectin‐9在口腔扁平苔藓患者全身的表达情况及具体作用机制尚不清楚，还需进一步研究。