c-erb-B2在早期胃癌术后复发预测中的作用

蔡志强，苏小岩，杨继元

荆州市第一人民医院肿瘤科，湖北 荆州434000

早期胃癌为局限于黏膜及黏膜下层的病变。有研究认为，早期胃癌的复发与区域淋巴结转移无关[1]，但对于早期胃癌复发的预测，目前尚无确切的分子生物标志物。C‐erb‐B2也称人表皮生长因子受 体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）或HER2/neu，是位于17号染色体上的原癌基因，其编码一种185 kD的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族成员[2‐3]。c-erb-B2扩增和过表达对于促进多种肿瘤的发生、发展具有重要作用[2‐4]。本研究分析了早期胃癌复发与患者临床特征的关系，探讨了c‐erb‐B2在早期胃癌复发预测中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年1月至2015年12月荆州市第一人民医院收治的178例经手术切除早期胃癌术后患者的胃癌组织标本，所有患者的随访资料均完整。参照日本胃癌研究学会（Japanese Research So‐ciety for Gastric Cancer，JRSGC）中关于早期胃癌的根治手术标准进行手术[5]。早期胃癌分型：隆起型、凹陷型、扁平型、混合型。淋巴结转移（N分期）参照美国癌症联合委员会（American Joint Commit‐tee on Cancer，AJCC）中关于胃癌的分期标准[6]。

1.2 检测方法

采用免疫组织化学染色（immunohistochemi‐cal，IHC）和荧光原位杂交（ fluorescence in situ hy‐bridization，FISH）技术检测c‐erb‐B2蛋白的表达情况和c-erb-B2基因的扩增状态。最终判定标准：IHC检测结果为强表达（＋＋＋），则直接确定为c‐erb‐B2阳性；IHC检测结果为阴性表达（-）和弱表达（＋），则直接判定为c‐erb‐B2阴性；IHC检测结果为中度表达（＋＋）则判定为不确定，须进一步应用FISH行c-erb-B2基因扩增状态检测（但仍可能出现结果不能确定的情况）。由两名经验丰富的胃肠病理学专家在不知情的情况对染色结果进行审查和分析，当阅片结果不一致时，通过FISH检测明确c-erb-B2基因的扩增情况。

1.2.1 IHC检测所有胃癌组织标本均经福尔马林固定，常规石蜡包埋。采用MaxEnVision法进行IHC，3 μm 厚切片，二氨基联苯胺（diaminobenzi‐dine，DAB）显色，苏木精复染，中性树胶封片。采用美国食品和药品管理局（Food and Drug Adminis‐tration，FDA）认证的IHC试剂盒对c‐erb‐B2进行检测，严格按照抗体使用说明书进行操作。对每张载玻片上的免疫染色进行评分[7]，细胞膜出现棕黄色颗粒为c‐erb‐B2阳性表达。随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，采用200倍光学显微镜观察IHC结果。IHC检测结果判定：细胞膜均未着色或≤10%的肿瘤细胞的细胞膜出现淡黄色颗粒，为阴性表达（-）；＞10%的肿瘤细胞的细胞膜呈淡黄色或存在隐约可见的细胞膜染色，染色间断，未包绕细胞膜，为弱表达（＋）；＞10%的肿瘤细胞的细胞膜呈黄色或棕黄色颗粒，染色连续，包绕细胞膜，为弱至中等强度表达（＋＋）；＞10%的肿瘤细胞的细胞膜呈深棕色，染色连续，包绕细胞膜，为强表达（＋＋＋）。

1.2.2 FISH检测c-erb-B2基因FISH试剂、探针及FISH操作步骤：石蜡包埋胃癌组织切片的预处理程序、操作步骤均按照试剂盒说明书进行，c‐erb‐B2 Hercep TestTMKit pharmDx TM Kit购自Dako Cyto‐mation公司。c-erb-B2基因的杂交信号显示为绿色，17号染色体着丝粒区（chromosome 17 centro‐mere locus，CEP17）的杂交信号显示为橘红色。在荧光显微镜下随机计数并观察3个区域的阳性信号，每个区域至少计数20个以上肿瘤细胞核内的c‐erb‐B2 信号点数和 CEN17 信号点数，计算平均值。以c‐erb‐B2/CEN17信号点数的比值确定c-erb-B2的状态，c‐erb‐B2/CEN17＜1.8提示无c-erb-B2基因扩增，c‐erb‐B2/CEN17≥2.2表示c-erb-B2基因扩增，c‐erb‐B2/CEN17处于 1.8～2.1 之间则判定为可疑[8]。若FISH检测结果为阳性，则判定为c-erb-B2阳性；若FISH检测结果为阴性，则判定为c-erb-B2阴性。

1.3 随访

对所有患者出院后进行常规随访。前2年每3个月随访一次，第3～5年每6个月随访一次，5年后每年随访一次，随访截至2017年12月。记录局部复发、腹膜复发和远处复发（包括其他器官转移、远处淋巴结复发和混合模式）情况。采用计算机断层扫描（CT）、内窥镜活检和正电子发射断层成像（positron emission tomography，PET）‐CT检查观察复发情况。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征的早期胃癌患者复发情况的比较

178例早期胃癌患者中，14例（7.87%）患者于随访期间复发，包括局部复发8例、远处复发5例、腹膜复发1例。不同性别、肿瘤浸润深度的早期胃癌患者的复发情况比较，差异均有统计学意义（χ2=4.834、4.705，P＜0.05）；不同淋巴结转移情况的早期胃癌患者的复发情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄、分化类型、手术方式、肿瘤位置、肿瘤分型和肿瘤直径的早期胃癌患者的复发情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

2.2 早期胃癌组织中c-erb-B2蛋白的表达情况

IHC结果显示，178例胃癌患者中，c‐erb‐B2阳性患者13例（8例复发），c‐erb‐B2可疑阳性患者6例（4例复发），c‐erb‐B2阴性患者 159例（2例复发）。不同c‐erb‐B2表达情况（c‐erb‐B2阳性、可疑阳性和阴性）胃癌患者的复发情况比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。c‐erb‐B2阳性和可疑阳性的胃癌患者的复发率均高于c‐erb‐B2阴性胃癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），而c‐erb‐B2阳性与可疑阳性胃癌患者的复发率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图1）

2.3 c-erb-B2基因可疑阳性早期胃癌患者的FISH检测结果

FISH检测结果显示，IHC结果为c‐erb‐B2可疑阳性的6例早期胃癌患者中，c-erb-B2扩增患者5例（复发4例，未复发1例），c-erb-B2未扩增患者1例（未复发）。5例c-erb-B2扩增的早期胃癌患者与1例c-erb-B2未扩增的早期胃癌患者的复发情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图2）

2.4 c-erb-B2基因状态与早期胃癌患者复发的关系

178例早期胃癌患者中，18例患者c‐erb‐B2阳性，包括复发患者12例和未复发患者6例；160例患者c‐erb‐B2阴性，包括复发患者2例，未复发患者158例。c‐erb‐B2阳性早期胃癌患者的复发率为66.67%，明显高于c‐erb‐B2阴性患者的1.25%，差异有统计学意义（χ2=86.733，P＜0.01）。

表1 不同临床特征早期胃癌患者的复发情况（ n=178）

图1 早期胃癌组织中c‐erb‐B2蛋白的表达情况（免疫组化染色，×40）

图2 荧光原位杂交技术检测c-erb-B2的扩增情况（DAPI染色，×1000）

3 讨论

胃癌是全球恶性肿瘤相关死亡的第二大原因，东亚国家晚期胃癌的病死率最高[9‐10]。相比之下，早期胃腺癌患者的5年生存率达90%以上[11]，这归因于早期上消化道内镜筛查[12]。临床特征可预测胃癌复发情况，Sawayama等[13]分析了429例未行术前化疗而行胃癌根治性切除术患者的临床特征与早期胃癌术后复发的关系，结果发现，429例患者中，有57例患者复发，且性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移情况、淋巴浸润、血管浸润与早期胃癌术后复发可能有关。

Chapelle等[14]研究发现，性别、淋巴结受侵情况是影响早期胃癌预后的重要因素。Liu等[15]发现肿瘤位置、区域性淋巴结转移、血管侵犯是胃腺癌患者预后的独立危险因素。本研究发观，年龄、分化类型、手术方式、肿瘤位置、肿瘤分型和肿瘤直径可能与早期胃癌的复发无关，但性别、淋巴结转移情况和肿瘤浸润深度可能与早期胃癌的复发有关。分子标记物与胃癌复发的预测有关。c-erb-B2基因能够预测早期胃癌患者的预后，其阳性率可能与早期胃癌患者的性别、肿瘤部位、TNM分期、远处转移、淋巴结转移情况、分化程度等有关[16‐17]。Kim 等[18]发现，复发组 c‐erb‐B2的阳性率约为18.8%（6/32）。本研究发现，复发患者的 c‐erb‐B2阳性率为85.7%（12/14），这可能与c‐erb‐B2的检测方法存在差异有关。IHC在蛋白质水平检测c‐erb‐B2的表达，由于蛋白质性质不稳定，在组织固定时会使抗原活性下降或消失，从而导致假阴性。FISH则是在DNA水平上检测c-erb-B2基因的表达，DNA性质稳定，结构不易破坏，直观、高度灵敏的荧光信号使不同操作者之间的判读差异减小。

IHC具有价格低廉、方法简便、快速、可使用普通光学显微镜观察、标本可较长时间常温保存等优点，是检测c‐erb‐B2蛋白的首选方法，但其容易受到如标本处理、试剂、仪器及人员等因素的干扰，且其仅是一种半定量检测方法，影响IHC结果的准确性。FISH具有特异性高、稳定性强、重复性好、定量检测等优点，实验过程中受到的影响较小，是检测c-erb-B2基因状态更加可靠的方法。2007年，美国临床肿瘤学会/美国病理学家学院指南推荐 IHC 和 FISH 作为 c‐erb‐B2的标准检测技术。Kim等[18]研究中c-erb-B2基因的阳性判断标准为IHC检测结果为2+和（或）IHC检测结果为3+，而本研究采用IHC和FISH联合检测基因c-erb-B2的状态，其阳性判断标准为IHC3+和（或）FISH扩增。有文献报道，IHC检测结果为2+时，HER2基因的扩增率为12%～15%[19]。Kim等[18]的研究中，部分IHC检测结果为2+的患者未进行FISH检测，故造成HER2基因阳性率偏低。

综上所述，淋巴结转移对早期胃癌复发的预测性较高，同样，c‐erb‐B2有助于预测早期胃癌复发。由于本研究纳入的病例数量有限，c-erb-B2基因在早期胃癌复发预测中的应用仍需前瞻性研究进一步证实。