液相色谱-串联原子荧光光谱法测定水产品中无机砷的不确定度评定

刘娜，陈飒

（陕西中检计量测试技术有限公司，西安 710068）

砷广泛存在于地壳、土壤、海水、河水、大气及食物中，极少以单质状态存在，几乎所有物质中都含有砷。砷是类金属元素，它的毒性及某些性质与重金属相似，所以也被列入重金属污染物范围内。砷的毒性与它的化学性质与离子存在价态有关。不同形态的砷化合物，其毒性差别较大，单质砷不溶于水，因此人体摄入后几乎不被吸收，完全排出，通常无害；有机砷，除砷化氢衍生物外，一般毒性较弱；无机砷中三价砷对细胞毒性最强，如As2O3，AsCb，H3AsO3，AsH3等化合物，均具有剧烈毒性；五价砷毒性较弱，在人体内被还原转化为三价砷后，才能发挥其毒性作用。人体和动物实验表明，无机砷化物容易被人体吸收。除了大量摄入时的急性中毒外，长期少量地摄入砷也会有致癌的风险［1-2］。2017年10 月27 日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单，砷和无机砷化合物列为一类致癌 物［3］。水生生物由于其生活习性易于富集高浓度的砷，从而导致水产品品质受到影响。因此更受到大家的关注［4-7］。

随着我国监管控制逐渐规范化，GB2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》［8］对水产品中无机砷提出了明确的限量要求，规定水产品（鱼类除外）中无机砷限量为0.5 mg／kg。因此检测水产品中无机砷的含量具有重要的意义和作用。

目前无机砷的测定方法主要有两种，一种是采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS），通过液相色谱柱对样品中多种形态的砷进行分离，利用电感耦合等离子体质谱仪进行分析测定，此方法操作简便，结果稳定，但电感耦合等离子体质谱仪价格高昂，运行成本也相对较高，而且此方法检测限量较之原子荧光光谱法略差；另一种是采用高效液相色谱-原子荧光光谱仪联用技术（HPLC-AFS），前处理方式相同，利用原子荧光光谱仪进行分析测定。原子荧光光谱仪均为国内生产，价格相对便宜，普通检测实验室均有配置，且此类设备灵敏度极佳，检出限优于HPLC-ICP-MS一个数量级之多。缺点是有时仪器运行不够稳定，平行性不够［9-10］。

我国食品安全国家标准，GB 5009.11-2014 《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》［11］中，对两种方法均允许使用。笔者依据此标准使用液相色谱联用原子荧光光谱仪平行检测了水产品中无机砷的含量，对整个测量过程中所有不确定度的来源进行了分析，对各个不确定的分量进行了评估和合成［12-13］，明确了测定结果不确定度和主要来源，对提高检测结果的准确度具有一定意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

原子荧光形态分析仪：SA50 型，配备有液相色谱部分和原子荧光反应与检测部分，北京吉天仪器有限公司；

色谱柱：PRP-X100 型，250 mm×4 mm，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：BSA224S 型，感量为0.000 1 g，德国赛多利斯公司；

离心机：Sigma 3 K15 型，德国西格玛公司；

pH 计：STARTER 3100 型，美国奥豪斯公司；

烘箱：Venticell 11 型，德国MMM 公司；

有机滤膜：孔径为0.45 μm，上海安谱实验科技股份有限公司；

C18小柱：BOND Elut C18型，500 mg，6 mL，美国安捷伦科技有限公司；

磷酸二氢氨、氢氧化钾、氨水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

硝酸、盐酸：光谱纯，国药集团化学试剂有限 公司；

正己烷：色谱纯，美国Fisher 公司；

三价砷标准溶液：编号为TPIV-CGAS(3)1-1，1 000 μg／mL，美国inorganic 公司；

五价砷标准溶液：编号为TPIV-CGAS(5)1-1，1 000 μg／mL，美国inorganic 公司。

1.2 实验方法

依据GB 5009.11-2014 《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》，使用液相色谱联用原子荧光光谱仪平行检测水产品中无机砷的含量。

1.3 样品处理

称取1.0 g 经食品匀浆机粉碎均匀的海螃蟹样品，置于50 mL 塑料离心管中，加入0.15 mol／L 的稀硝酸20 mL，封口，预消解过夜（约15 h）。将样品置于90℃烘箱中热浸提2.5 h，每半小时振摇1 min。冷却至室温，置于离心机中以8 000 r／min 离心15 min。取上清液5 mL，加入5 mL 正己烷，振摇1 min，置于离心机中以8 000 r／min 离心15 min，弃上层正己烷，再加5 mL 正己烷重复萃取一次。取下层清液，过孔径为0.45 μm 的有机滤膜，用C18小柱净化后上机进行测定。

1.4 数学模型

在生物体内和样品前处理过程中，三价砷与五价砷可以相互转化，三价砷相对比较稳定，按照标准方法，如单独测定三价砷或五价砷，结果平行性并不好，回收率时高时低，大多数情况下，三价砷回收率偏高而五价砷回收率偏低，但总无机砷含量基本恒定［2］，因此检测标准规定是以三价砷与五价砷加和总量计算，即讨论无机砷总量的 检测。

三价砷与五价砷均采用外标法定量，按式(1)

计算含量：

式中：X——样品中无机砷含量，mg／kg；

c——测定溶液中无机砷浓度，μg／L；

c0——空白溶液中无机砷浓度，μg／L；

V——试样消解液总体积，mL；

m——试样质量，g；

1 000——换算系数。

总无机砷含量等于三价砷含量与五价砷含量之和。计算结果保留两位有效数字。

1.5 不确定度来源

无机砷含量测定结果不确定度的来源主要有以下几个方面：

（1）重复性实验导致的不确定度。包括样品均匀性、天平称重重复性、体积重复性和回收率重 复性。

（2）样品溶液制备过程引入的不确定度。包括试样质量和浸提萃取引入的不确定度。

（3）标准溶液配制引入的不确定度。包括标准储备液的不确定度和稀释所引入的不确定度。

（4）标准曲线拟合产生的不确定度。

具体来源详见图1。

图1 不确定度主要来源图

2 结果与讨论

2.1 样品测定

依据GB 5009.11-2014 《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》检测6 个平行样品，同时测定空白。平行检测2 个空白得到空白结果均为0，故测得值即为检测值，计算结果列于表1。

表1 无机砷平行测定结果

2.2 A 类不确定度

无机砷标准偏差s=0.001 1 mg／kg，平行测定次数n=6，则A 类不确定度：

A 类相对不确定度：

2.3 B 类不确定度

2.3.1 样品溶液制备过程引入的不确定度urel(pre)

（1）样品称量引入的不确定度urel(m)。称量使用万分之一天平，按均匀分布计算，不确定度u(m)=0.1／ 3 =0.058 mg，称样量平均为1 g，则样品称量引入的不确定度urel(m)=0.058／1 000=0.000 06。

（2）浸提萃取时引入的不确定度。所使用20 mL 单标移液管（A 级）的校准证书中给出不确定度为0.02 mL，则带来的不确定度urel(V20)=0.02／20=0.001。

2.3.2 标准溶液配制产生的不确定度urel(C)

（1）三价砷标准储备液。浓度为1 000 μg／mL，证书给出的扩展不确定度为4 μg／mL，则标准不确定度u(CAs3+)=4／2=2 (μg／mL)，相对标准不确定度urel(CAs3+)=2／1 000=0.002。

（2）五价砷标准储备液。浓度为1 000 μg／mL，证书给出的扩展不确定度为4 μg／mL，则标准不确定度u(CAs5+)=4／2=2 (μg／mL)，相对标准不确定度urel(CAs5+)=2／1 000=0.002。

（3）移液器引入的不确定度。使用100 μL 可调移液器，校准证书给出不确定度为0.9 μL，则标准不确定度urel(V100)=0.9／100=0.009。

将上述不相关分量不确定度进行合成，得到标准溶液配制引入的不确定度：

2.4 标准曲线拟合引入的不确定度

（1）三价砷标准曲线拟合引入的不确定度urel(C1)。采用5 个不同浓度的三价砷标准溶液，按照标准进行测定得到相应的光谱强度值yi，测量数据见表2。对其进行一元线性拟合，得到直线方程。

表2 三价砷标准曲线测定数据

其中，S(y)=3 574.49，则u(C1)=0.490 01。

三价砷（As3+）标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C1)=u(C1)／C1=0.086。

（2）五价砷标准曲线拟合引入的不确定度urel(C2)。采用5 个不同浓度的五价砷标准溶液，得到相应的光谱强度值yi，测量数据见表3。对其进行一元线性拟合，得到直线方程。

表3 五价砷标准曲线测定数据和计算结果

拟合得到校正标准曲线y=5 817.3x+3 345.9，则截距a=3 345.9，斜率b=5 817.3，R2=0.9 995。对试样测定6 次，五价砷的平均浓度C2=4.1 μg／L，则n=6，标准曲线5 个点，重复测3 次，P=15，则五价砷标准曲线拟合引入的标准不确定度按式(1)计算，其中，S(y)=8 889.37，则u(C2)=0.657 27。

五价砷（As5+）标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C2)=u(C2)／C2=0.160 3。

2.5 合成标准不确定度

将上述各不相关不确定度分量进行合成，得到合成不确定度：

u(X)=X·urel(X)=0.196×0.182 2=0.035 7 (mg／kg)。

2.6 扩展不确定度和结果表示

水产品中无机砷含量的扩展不确定度，取包含因子k=2，扩展不确定度：

U(X)=2×u(X)≈0.071 mg／kg。

3 结语

液相色谱-串联原子荧光光谱法测定水产品中无机砷的不确定度来源为重复性实验导致的不确定度；样品溶液制备过程引入的不确定度；标准溶液配制引入的不确定度；标准曲线拟合产生的不确定度。由不确定度各分量的评估结果可看出，实验的各个因素均可对不确定度贡献，其中标准曲线拟合引入的不确定度为主要分量，增加标曲点数可以降低该不确定度分量。研究着眼于标准方法的实际应用，对不同仪器和分析对象也具有参考意义。