一株野生羊肚菌的分离鉴定及其生物特性初探

范冬茹 郭 兴 王丹丽 马 珂 高智涛

（伊春林业科学院，黑龙江伊春153000）

羊肚菌（Morchella denta）又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等，隶属于子囊菌亚门（Aseomycoti—na）、盘菌（Diseomyeetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属（Morchella）[1]。羊肚菌野生资源分布较广，我国陕西、甘肃、青海、四川、云南、河北、内蒙古、吉林、黑龙江等20 多个省（区）均有分布，但采收量稀少[2]。

伊春市位于中国黑龙江省东北部小兴安岭腹地的汤旺河流域，属寒温带大陆性季风气候，森林覆盖率约为82.2%，拥有亚洲面积最大、保存最完整的红松原始林。伊春地区野生食药用真菌资源非常丰富，夏秋两季是野生菌的发生期，其中羊肚菌也时有发生，但有关该地区野生羊肚菌资源的种类和分类少有报道。笔者对伊春地区的一株野生羊肚菌进行分离、鉴定，并对菌丝的生长特性进行分析，以期为羊肚菌的人工驯化和资源利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试羊肚菌

野生羊肚菌2019 年6 月14 日采自黑龙江省伊春市伊春区小兴安岭植物园内，编号为YYC-1。测量其子实体整体长度、菌盖高度等。

1.2 供试培养基

菌种分离及保存培养基（PDA 培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

液体基础培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白 胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，pH 自 然 ，水1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种分离与鉴定

采用孢子分离方法中的弹射法[3]获得纯菌种。将分离出的菌种送生工生物工程（上海）股份有限公司进行ITS 的分子鉴定。首先提取菌丝体总DNA，ITS 部分序列 PCR 扩增用真菌 ITS 通用引物ITSl 和 ITS4，PCR 反应体系 25 μL。产物回收并测序，利用BLAST在线比对进行序列分析。

1.3.2 菌丝培养试验

1.3.2.1 菌丝斜面培养

选取菌丝生长旺盛、速度一致的试管种，挑取相同大小的菌块接种于PDA斜面，放置20 ℃的恒温培养箱中培养，10 个重复。每天观察菌丝颜色变化及菌丝长势直至菌丝长满试管，并根据测得的菌丝生长长度和培养天数计算菌丝平均生长速度。

1.3.2.2 菌丝生长适宜碳氮源试验

以液体基础培养基中的葡萄糖和蛋白胨含量为标准，用相同含量的蔗糖、乳糖、可溶性淀粉代替基础培养基中的碳源，用相同质量酵母浸膏、黄豆粉、尿素代替基础培养基中的氮源。250 mL 三角瓶装液150 mL，3个重复。培养基灭菌后，在无菌条件下，分别将10个活化的菌块接入各培养基中，20 ℃，转速150 r/min，培养7 d。培养结束后将发酵液倒入抽滤瓶中抽滤，抽滤过程中加入少许流动蒸馏水冲洗菌丝体，抽滤后得到较干的菌丝体，再放置于烘箱中，70 ℃烘干后称量。

1.3.2.3 pH试验

用NaOH、HCl 将基础培养基的 pH 分别调为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。每个处理重复3 次。培养方法及菌丝体生物量测定同1.3.2.2。

1.4 统计学分析

所有数据采用SPSS21 统计软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 野生羊肚菌的形态特征

所采集的野生羊肚菌YYC-1为黄色羊肚菌（图1）。子实体中等大小，平均长度为11 cm，平均宽度为5 cm，菌盖棕黄色、卵圆形，凹坑不规则扭曲，菌柄长约5 cm，宽约3 cm。

2.2 羊肚菌YYC-1的菌株鉴定及系统发育

菌株扩增的ITS 片段经测序得到一个长度为1 162 bp 的序列（图2），将此结果在 NCBI 上BLAST 比对（限于篇幅，省略比对表）。结果，最大匹配值为2 109～2 084，对比程度大；覆盖率最高可达99%；E 值为0，说明对比完成匹配；最大一致性为99.74%～99.14%，表明对比结果相似性极高。综合得出，在10 个对比结果中，YYC-1 与8 组粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）相似程度较高，可以初步确定该野生羊肚菌菌株为粗腿羊肚菌。

2.3 菌丝培养结果

2.3.1 斜面培养结果

斜面培养1 d 后全部萌发，菌丝洁白纤细，平均生长长度为5.04 mm；接种5 d 后，菌丝变为浅黄色，菌丝较密；接种6 d 后，全部满管，平均生长长度为16.88 mm，且菌丝变为黄褐色（图3）；接种第10 天，菌丝浓密，气生菌丝较多，颜色转为深褐色，表面有少量菌核出现。

图1 野生羊肚菌子实体

图2 PCR电泳图谱

图3 接种6 d时菌丝状态

2.3.2 碳源对YYC-1菌丝生长的影响

由表1 可知，野生羊肚菌YYC-1 在供试碳源培养基中均可生长，菌丝体生物量存在显著差异。菌丝体生物量大小依次为葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞可溶性淀粉，且葡萄糖与其他三种碳源在0.05 水平上差异显著；以葡萄糖、可溶性淀粉为碳源的发酵液颜色呈浅黄色，以蔗糖、乳糖为碳源的发酵液颜色呈褐色（图4）。综合菌丝长势，YYC-1 的最适碳源为葡萄糖。

表1 碳源对YYC-1菌丝生长的影响

图4 不同碳源发酵液颜色

2.3.3 氮源对YYC-1菌丝生长的影响

由表2 可知，野生羊肚菌YYC-1 在供试氮源培养基中均可生长。菌丝体生物量大小依次为酵母浸膏＞黄豆粉＞尿素＞蛋白胨，且酵母浸膏与其他三种氮源在0.05 水平上存在显著性差异；以酵母浸膏、黄豆粉为氮源的发酵液颜色呈浅黄色，以尿素、蛋白胨为氮源的发酵液颜色呈褐色。综合菌丝长势，YYC-1的最适氮源为酵母浸膏。

表2 氮源对YYC-1菌丝生长的影响

2.4 pH对YYC-1菌丝生长的影响

由表3 可知，野生羊肚菌 YYC-1 在 pH 为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的培养基中均可生长，当 pH 在6.0～7.5 时，随着pH 上升，菌丝体生物量不断增加、菌丝长势由弱变强、发酵液颜色由浅变深；当pH 为8时，菌丝生物量有所下降、菌丝长势变弱，表明YYC-1适合在偏碱性的培养基中生长，最适pH为7.5。

表3 pH对YYC-1菌丝生长的影响

3 小结

编号为YYC-1 的野生羊肚菌采自小兴安岭伊春地区阔叶次生林林下。采集地生境枯枝落叶层较厚，腐殖质较多（符合食用菌对有机质的要求），采集当年的雨水较多，土壤湿润，为羊肚菌的生长提供良好生态条件。YYC-1扩增的ITS片段经测序得到一个长度为1 162 bp的序列，在BLAST比对后，确定其为粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）。对YYC-1 生长所需的碳源、氮源、pH 三个因素试验，结果表明，其生长最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母浸膏，最适pH为7.5。