环状RNA在女性生殖系统中的研究进展

张雪颖，应小燕，许波群

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类共价闭合的成环非编码RNA，最早在研究植物类病毒时发现，但当时被当作基因剪切废物未受重视。CircRNA不含5′端帽子和3′端Poly尾巴，可抵抗核酸外切酶的降解作用，具有保守性、稳定性、组织特异性[1-2]等特点，这为其作为疾病诊断标志物及疾病靶向药物的研制提供可能。近几年，随着测序技术和生物信息学的发展，越来越多的circRNA被鉴定出。CircRNA广泛存在于各种生命体内，可发挥细胞信号传导、基因调控、蛋白质翻译等生物功能，参与各种生理和病理过程，其异常表达影响乳腺癌[3]、糖尿病[4]、椎间盘退变[5]等疾病的发生、发展。随着研究进展，其在女性生殖系统疾病的研究也逐渐深入。本文就circRNA的生物学特性、功能以及近年来其在女性生殖系统疾病中研究进展及潜在临床价值进行综述。

1 CircRNA概述

1.1 CircRNA的分类及形成、降解机制 CircRNA是一种具有闭合环状结构的非编码RNA，即前体mRNA（pre-mRNA）经选择性剪切后5′端和3′端反向以共价结合的方式拼接而成，其广泛存在于多种组织、细胞、外泌体中，且在不同物种间高度保守[1]。人体存在内源性circRNA和外源性circRNA，前者广泛存在于真核细胞的细胞质中，而后者则多存在于血液、体液、唾液等。

CircRNA由编码基因环化而成，根据其来源，可分为外显子circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、内含子circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）、外显子-内含子circRNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA）和基因间区circRNA（intragenic circular RNA，icircRNA）四大类，其中ecircRNA占circRNA的绝大多数且位于细胞质，其他则主要位于细胞核。关于各类circRNA的成环机制，主要有外显子套索环化、内含子互补配对环化、RNA结合蛋白驱动环化及内含子套索环化等模型。Jeck等[6]研究认为，在转录过程中，pre-mRNA发生折叠，拉近原本不相邻的外显子，通过套索剪接形成ecircRNA或EIciRNA；内含子区域存在的反向互补序列或ALU重复序列使其本身互补配对，从而介导pre-mRNA反向剪切，形成ecircRNA或EIciRNA。Pre-mRNA经典剪切过程中形成内含子套索，5′端富含的GU、3′端富含的C重复序列使其稳定，最终形成ciRNA[7]。RNA结合蛋白与内含子相互作用，使内含子侧翼序列相互靠近，介导反向剪接，外显子头尾相接形成circRNA[8]。

有学者提出RNA内切酶降解circRNA的假设，但未深入探究验证。既往有学者发现微小RNA-671（miR-671）可介导RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）的核心元件AGO2区域切割以降解小脑变性相关蛋白1（CDR1）及其来源的circRNA[9]。近期，Jia等[10]研究发现进化保守因子GW182参与大量circRNA的降解过程。然而，circRNA的降解机制仍无成熟理论体系，有待进一步研究。

1.2 CircRNA的生物学功能与机制 CircRNA广泛参与各种生理病理过程，具有以下生物功能：①调节细胞增殖，研究表明circRNA可通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）[11]信号通路或影响细胞周期进展[3]而调控细胞增殖；②促进上皮-间质转化（EMT）以加速癌变[12]；③参与细胞分化[13]；④促进胰岛素分泌[4]；⑤调控细胞凋亡[5]。

CircRNA发挥生物功能的机制主要取决于其类型。广泛分布于细胞质的ecircRNA具有微小RNA（miRNA）结合序列，可发挥海绵吸附作用[14]，竞争性结合miRNA，使后者活性大大降低，从而解除其对mRNA上靶基因的抑制作用，从而调控下游信号传导。CircRNA也可以直接与RNA结合蛋白相互作用，有研究证明ecircRNA可作为mRNA编码蛋白或多肽[15]。CiRNA、EIciRNA多位于核内，ciRNA通过与RNA聚合酶Ⅱ（RNA-polⅡ）的相互作用顺式调控其来源基因的表达[7]；EIciRNA通过招募U1小RNA蛋白复合物（U1snRNP），与polⅡ在基因启动子区相互作用，促进其来源基因的转录表达[16]。

CircRNA生物学功能如图1[17]所示，circRNA经反向互补序列或RNA结合蛋白的结合而生成，并从细胞核输出（见图1①）。在细胞质中circRNA可与多种物质结合，可结合RNA结合蛋白（见图1②）、海绵效应吸附miRNA（见图1③）、核糖体（见图1④），也可结合内切酶形成退化的circRNA（见图1⑥）、或直接降解（见图1⑤）。从非降解途径看，circRNA结合复合物可在细胞质中扩散，也可主动运输到细胞的特定区域从而进行物质释放或翻译（见图1⑦）。囊泡将circRNA或结合复合物包裹并运送出细胞质（见图1⑧）。在囊泡的保护下，circRNA及其复合物可到达其他细胞或组织，作为信使分子或完成未知的功能（见图1⑨）。

2 CircRNA与女性生殖系统肿瘤

女性生殖系统肿瘤有良性、交界性（卵巢）及恶性之分，可发生于女性生殖系统的各个部位，恶性肿瘤以宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌最多发，卵巢上皮癌在女性生殖系统恶性肿瘤中死亡率最高[18]。恶性肿瘤的病理分期对制定治疗方案、判断预后有重要指导意义，早期诊断尤为重要。CircRNA保守、稳定、组织特异的生物学特性，使其有可能成为妇科恶性肿瘤的特异报警标志物，也为研制疾病靶向药提供新方向。近年来，circRNA在妇科肿瘤方面的研究成为热点。

2.1 CircRNA与宫颈癌 高通量测序及微阵列等技术[19]鉴定出越来越多与宫颈癌相关的circRNA，进一步加速circRNA在宫颈癌发生、发展中的机制研究。研究发现，has_circ_0023404在宫颈癌患者及多种人宫颈癌细胞系中过表达，荧光免疫实验表明其靶向调节miR-136，而后者则为多种肿瘤的抑制因子；功能试验表明，has_circ_0023404经miR-136促进转录因子CP（TFCP）表达以激活Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）通路，最终促进宫颈癌发展[20]。Liu等[18]研究发现circRNA8924（has_circ_0141539）在宫颈癌患者中表达升高，并与肿瘤大小、国际妇产科联盟（FIGO）分期、子宫肌层浸润等临床病理因素相关，其与miR-518-5p/miR-519-5p家族竞争结合以调节CBX8表达，促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。研究发现，circRNA000284在5种宫颈癌细胞系中表达均上调，并经海绵吸附miR-506从而使抑制Snail-2的降解，最终促进宫颈癌的发展[21]。CircRNA充当竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），经海绵吸附miRNA以调控细胞间信号传导，最终影响恶性肿瘤进展，这类机制研究成果丰富[3，11-12，18，22-24]，见表1。而Abdelmohsen等[25]从蛋白调节的角度证实了circRNA在宫颈癌中的作用。HuR是一种RNA结合蛋白，可与多种RNA结合进而调节蛋白质表达，该研究发现circPABPN1（has_circ_0031288）为HuR靶标，其可显著抑制HuR与PABPN1 mRNA结合，从而抑制PABPN1翻译为蛋白，最终减弱宫颈癌细胞增殖。

图1 CircRNA生物学功能图示[17]

2.2 CircRNA与子宫内膜癌 分别取Ⅰ期、Ⅲ期子宫内膜癌患者内膜组织与正常人群内膜组织进行circRNA转录组分析，发现大量差异表达的circRNA，其中多为ecircRNA[26-27]。Chen等[27]研究发现，与正常人相比，子宫内膜癌患者内膜组织中circRNA总丰度更低，这与Bachmayr-Heyda等[28]部分研究结果契合，提示形成circRNA的反向剪接机制可能在恶性组织中受损，也可能是细胞过度增殖导致circRNA被动稀薄。Xu等[29]从血清外泌体中提取circRNA进行分析，发现has_circ_0109046和has_circ_0002577在子宫内膜癌患者中过表达，有望作为子宫内膜癌的新型无创标志物。

2.3 CircRNA与卵巢癌 卵巢肿瘤是常见的妇科肿瘤，因其早期病变不易发现，一旦出现症状多为晚期。上皮性卵巢癌好发于50～60岁的妇女，5年生存率约30%～40%，死亡率居妇科恶性肿瘤首位，应予以高度重视。Ahmed等[30]对卵巢癌患者的原位病灶和转移病灶（包括腹膜和淋巴结）进行对比鉴定研究，发现与mRNA相比，circRNA在原发病灶和转移病灶之间的差异性更大；转移病灶中的mRNA激活核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB）、PI3K/AKT、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等细胞增殖信号通路，而circRNA却抑制以上信号通路。因此该研究提出circRNA更适合作为癌症的高度异质性生物标志物。CircPLEKHM3在卵巢癌中的低表达，其与患者预后呈正相关，而AKT抑制剂MK-2206可阻断因circPLEKHM3低表达所引起的促肿瘤作用，还可增强紫杉醇的抗癌效应[24]，为卵巢癌的治疗带来新希望。CircMAN1A2在鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌、肺癌等多种恶性肿瘤患者的血清中异常升高，受试者工作特征（ROC）曲线下面积分别为0.911、0.779、0.734、0.694、0.645[31]，提示circMAN1A2作为恶性肿瘤血清新型标志物具有较大价值。随着研究进展，circRNA经海绵吸附miRNA进而调控各类卵巢癌进展的机制逐步显现，靶向circRNA作用位点进而治疗卵巢癌的新方法有望成功。

表1 CircRNA海绵吸附miRNA调控肿瘤的发生、发展

3 CircRNA与女性生殖内分泌疾病

女性生殖内分泌疾病主要表现为下丘脑-垂体-卵巢轴异常，常见疾病如多囊卵巢综合征（PCOS）、高催乳素血症等。雄激素异常增高、卵泡囊性扩张和无排卵是PCOS的主要表现。在PCOS患者卵丘细胞中已鉴定出大量差异表达的circRNA[32]。Zhang等[33]对颗粒细胞中的circRNA表达谱进行分析，发现has_circ_0001577在PCOS患者中显著上调，而has_circ_0020093则显著下调。研究表明，PCOS患者卵泡外泌体中的circRNA也存在差异表达[34]。鉴于卵丘细胞和颗粒细胞是合成、分泌雄激素的重要部位，卵泡液含有大量生殖细胞分泌物，这些部位的circRNA存在差异表达，说明其在PCOS发生、发展过程中发挥重要作用。在垂体水平，circOMA1通过miR-145-5p靶向肿瘤蛋白翻译调节因子1（tumor protein translationally-controlled 1，TPT1），从而抑制非功能性垂体腺瘤的生长[35]，从而引起垂体功能低下、不育。

4 CircRNA与子宫内膜异位症和子宫腺肌病

子宫内膜异位导致子宫内膜异位症和子宫腺肌病，临床表现为女性慢性盆腔痛、进行性痛经及不孕，严重影响女性生活质量。Xu等[36]对子宫内膜异位症患者和正常女性子宫内膜中的circRNA进行鉴定分析，发现11个circRNA表达上调，77个circRNA表达下调，其中circ_0004712、circ_0002198表达明显上调。Zhang等[37]经微阵列分析在子宫内膜异位症患者中鉴定出2237个异常表达的circRNA，其中8个参与EMT过程。进一步的功能试验表明，has_circ_0067301经miR-145-5p调节Notch1癌基因信号通路，促进子宫内膜异位的EMT发展[38]。CircRNA在子宫内膜异位症中作用机制的研究较少，进一步深入研究或许可挖掘circRNA的潜在治疗价值。

5 CircRNA与产科并发疾病

体外受精-胚胎移植过程中，很多妇女胚胎质量较好却反复植入失败，这与子宫内膜容受性有关；而胚胎植入成功后流产，则与卵泡受损及早发性卵巢功能不全等相关。追踪人类植入前胚胎的circRNA表达谱，发现大量circRNA在受精前即存在并于植入前持续存在，提示它们对母源RNA的降解有抵抗性，并在一定程度上影响子宫内膜的容受性[39]。Cheng等[40]研究发现circRNA-103827和circRNA-104816的表达与母体年龄呈正相关，与优质胚胎数呈负相关，其可能是卵泡微环境受损的潜在指标，进一步提示这些异常circRNA与卵巢衰老之间存在密切联系。这些基础研究为改善卵巢中卵泡微环境的治疗带来新思路，有望减少不明原因流产的发生。

妊娠期高血压疾病是一类妊娠与高血压并存的疾病，严重者可出现微小血管硬化痉挛，从而危及孕产妇及胎儿的健康。提前预测孕妇发病风险并进行预防，将大大减少临床发生风险。Zhang等[41]通过微阵列分析子痫前期和正常孕妇的血清，发现大量异常表达circRNA可能与其发病有关。若检测到circ101222上调，联合血浆蛋白因子-内皮糖蛋白（ENG）可大大提高子痫前期的预测率，敏感度为0.707 3，特异度为0.804 9。但该研究未区分子痫前期严重程度，这或许是其临床应用的局限性。早期胎盘的血管生成和抗血管生成失衡是妊娠并发症（包括子痫前期）发病的主要原因。miR-17有促进早期胎盘血管生成的作用[42]，Qian等[43]在子痫前期孕妇胎盘组织中鉴定出较多上调的circRNA，其中多个circRNA与miR-17有预测结合位点，提示这些上调的circRNA可能在调控胎盘血管生成、滋养细胞分化及宿主防御等过程中发挥作用。

6 结语与展望

近年来circRNA研究较多，但目前对于circRNA的降解机制仍无完善的理论体系。CircRNA功能研究主要集中在ecircRNA海绵吸附miRNA机制，针对细胞核内的调控研究较少。在研究方法上，应着重减少实验方法检测的假阳性率。除肿瘤研究外，其他亟待解决的女性生殖问题也应加大研究力度，尤其在女性内分泌及不孕等领域中还有极大探索空间。CircRNA的生物学特性使其在血液、唾液中含量丰富稳定，其组织特异性、各项生物功能预示其作为无创疾病诊断预测分子的可能。而其在肿瘤中确切的海绵吸附功能，也让我们有机会创造人工circRNA靶向治疗药。

（收稿日期：2020-02-08）

[本文编辑 杨晓园]