子宫内膜癌组织中错配修复蛋白的表达情况及与患者免疫功能和微卫星不稳定的关系

于文亮，潘长清，郑茜文

绵阳市中心医院妇产科，四川 绵阳 621000

子宫内膜癌是一类常见的妇科恶性肿瘤，研究显示其发病率居全部妇科恶性肿瘤的首位[1-2]。国内流行病学调查显示，2015年中国子宫内膜癌新发病例超过6万例，发病率仅次于宫颈癌[3]。肿瘤微环境是指肿瘤细胞发生发展所处的内外环境，其在肿瘤细胞侵袭、转移及预后中均具有重要意义[4-6]。肿瘤微环境中的淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞，对患者预后具有重要意义。影响肿瘤微环境淋巴细胞浸润水平的因素十分复杂，临床上认为新抗原的产生可能是其机制之一，而错配修复（mismatch repair，MMR）蛋白与新抗原的产生密切相关[7]。有研究表明，存在MMR蛋白缺失的结直肠癌组织中淋巴细胞浸润水平显著高于MMR蛋白表达的结直肠癌组织[8]，但目前尚无研究报道在子宫内膜癌中是否存在相似的现象。自1981年首次提出微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）的概念后，大量研究者关注其在肿瘤发生发展中的作用，并探讨其与MMR蛋白表达的相关性，但目前关于其与子宫内膜癌的研究报道较少。基于此，本研究通过分析子宫内膜癌中常见的4种MMR蛋白（PMS2、MLH1、MSH2、MSH6）的表达情况，并探讨MMR蛋白表达情况与患者免疫功能及MSI的关系，旨在为临床上评价患者预后提供依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2011年3月至2018年3月于绵阳市中心医院确诊的82例子宫内膜癌患者。纳入标准：①经病理检查诊断为子宫内膜癌；②在确诊前半年内未接受过相应的肿瘤治疗或激素治疗；③未合并其他严重疾病。排除标准：①合并免疫系统、内分泌系统及其他系统严重疾病；②依从性差；③既往有子宫或宫颈手术史。82例患者的年龄为31～59岁，平均年龄为（43.8±5.4）岁；非子宫内膜腺癌8例（浆细胞癌5例，透明细胞癌3例），子宫内膜腺癌74例；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ期55例，Ⅱ期13例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例。采集患者的病理组织制成石蜡标本，并分为2份，一份用于免疫组织化学染色，另一份用于提取DNA并进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），同时采集患者的正常子宫内膜组织作为对照。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者及家属均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 将组织蜡块连续切取3～5 μm厚切片，采用免疫组化Envision二步法进行检测。切片通过脱水和水化后，进行热修复，然后加入3%H2O2溶液避光孵育20 min。采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3次，每次5 min。加入一抗溶液（MLH1抗体稀释度为1∶50，MSH2抗体稀释度为1∶200，MSH6抗体稀释度为1∶150，PMS2 抗体稀释度为1∶50，CD4+抗体稀释度为 1∶200，CD8+抗体稀释度为 1∶150），置于4℃冰箱中避光孵育过夜。PBS清洗3次，每次5 min，加入生物素标记的二抗，37℃避光孵育30 min。PBS清洗3次，每次5 min。通过现配的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液进行显色，苏木精复染，中性树胶封片，于光学显微镜下进行观察。抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司。采用已知的阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 PCR 提取肿瘤组织DNA，检测5个微卫星标记，引物序列购自北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司（表1）。扩增条件：95℃预变性15 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32个循环；72℃延伸25 min。4℃保存。将扩增后的微卫星片段经95℃变性5 min后进行毛细管电泳，采用Gene Mapper4.1对微卫星片段进行分析。

1.3 结果判定

1.3.1 MMR蛋白表达缺失判定 MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达定位于细胞核，黄色或棕褐色为阳性，阴性即为表达缺失。判读结果时，应注意内对照的选择，非肿瘤性的内膜间质、腺体及淋巴细胞核应棕黄色阳性着色。只有在内对照阳性背景下的肿瘤细胞核的表达完全缺失才能认为有效，此外还应注意对肿瘤组织区域进行评估，而不应选择非肿瘤区域如增殖症区域[9-10]。

表1 MSI位点的引物序列

1.3.2 T淋巴细胞浸润情况 CD4+和CD8+的表达定位于淋巴细胞膜，棕黄色为阳性。每张切片随机检阅至少5个高倍镜（×400）视野，每个视野至少计数200个细胞。取5个区域淋巴细胞数平均值。

1.3.3 MSI 阳性判定 肿瘤组织和同一患者的正常组织DNA在同一条件下电泳，若出现完全一致的电泳条带，则为MSI阴性，若出现条带的移动、缺失或额外条带，则为MSI阳性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMR 蛋白表达缺失情况

82例子宫内膜癌患者中，PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表达缺失例数分别为8例、7例、6例和13例，蛋白表达缺失率分别为9.8%、8.5%、7.3%、15.9%。总蛋白表达缺失率为35.4%（29/82），其中单个蛋白缺失24例，2个蛋白联合缺失5例（3例MLH1/PMS2蛋白缺失，2例MSH2/MSH6蛋白缺失）。

2.2 不同临床特征子宫内膜癌患者中MMR蛋白表达缺失情况的比较

不同FIGO分期、浸润深度子宫内膜癌患者中MMR蛋白表达缺失率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。年龄＞50岁、有淋巴结转移子宫内膜癌患者中MMR蛋白表达缺失率分别明显高于年龄≤50岁、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。子宫内膜腺癌患者中MMR蛋白表达缺失率明显高于非子宫内膜腺癌患者，差异有统计学意义（P＜0.01）；低分化子宫内膜腺癌患者中MMR蛋白表达缺失率明显高于中分化和高分化子宫内膜腺癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 不同临床特征子宫内膜癌患者中MMR蛋白表达缺失情况的比较（n=82）

2.3 MMR 蛋白表达缺失和未缺失子宫内膜癌患者中CD4+及CD8+水平的比较

MMR蛋白表达缺失患者的CD4+水平为（74.27±10.26）%，明显高于MMR蛋白表达未缺失患者的（35.91±8.42）%，差异有统计学意义（t=18.237，P＜0.01）；MMR蛋白表达缺失患者的CD8+水平为（70.31±6.32）%，明显高于MMR蛋白表达未缺失患者的（35.28±10.97）%，差异有统计学意义（t=18.341，P＜0.01）。

2.4 不同临床特征子宫内膜癌患者中MSI发生情况的比较

82例患者中，MSI阳性17例，阳性率为20.73%。年龄＞50岁子宫内膜癌患者的MSI阳性率高于年龄≤50岁的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；子宫内膜腺癌患者的MSI阳性率高于非子宫内膜腺癌患者，低分化子宫内膜腺癌患者的MSI阳性率低于中分化和高分化子宫内膜腺癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同FIGO分期、浸润深度、淋巴结转移情况子宫内膜癌患者的MSI阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

2.5 MSI与MMR 蛋白表达的关系

17例MSI阳性患者中，MMR蛋白表达缺失15例，缺失率为88.24%，65例MSI阴性患者中，MMR蛋白表达缺失14例，缺失率为21.54%。MSI阳性患者中MMR蛋白表达缺失率明显高于MSI阴性患者，差异有统计学意义（χ2=26.225，P＜0.01）。

表3 不同临床特征子宫内膜癌患者中MSI情况的比较（n=82）

3 讨论

MMR基因具有保守性，而这一特性在基因组的稳定性以及DNA复制的忠诚性中具有重要意义。突变的MMR蛋白可能会增加肿瘤的发生风险，其可能的机制为突变导致MSI或错误复制引起基因组不稳定，进而促进癌基因与抑癌基因异常表达，最终导致某些细胞的无序及无限制增殖[11-12]。研究发现，子宫内膜癌细胞中MMR基因突变率较高，其可能的原因为当MMR基因发生突变时，MMR蛋白表达过低或缺失，造成MMR修复功能障碍，而由于机体难以及时修复DNA复制过程中的异常，从而导致“滑链错配”、复制差错、染色体互换不均匀等的发生，造成微卫星DNA的长度改变，引发MSI，最终对细胞的正常增殖造成一定影响，为肿瘤的发生发展提供了有利环境，同时癌基因和抑癌基因异常表达也会诱发肿瘤组织的形成[13-14]。流行病学调查显示，具有MMR基因突变的女性子宫内膜腺癌的发生风险为40%～60%，而在正常人群中，这一比例仅约2.3%[15]。子宫内膜癌组织中不同MMR蛋白表达的缺失率不同，MLH1蛋白表达缺失率为24%～28%，MLH2为7%～8%，MLH6为6%～21%，PMS2为28%～40%[16-17]。本研究结果显示，82例子宫内膜癌组织中，PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表达缺失率分别为9.8%、8.5%、7.3%、15.9%，总蛋白表达缺失率为35.4%，与上述研究结果较为一致。

影响MMR蛋白表达缺失的因素十分复杂，有研究报道，相较于年龄低于50岁的子宫内膜癌患者，年龄超过50岁的子宫内膜癌患者MMR蛋白表达缺失率更高。本研究结果显示，年龄＞50岁、有淋巴结转移子宫内膜癌患者中MMR蛋白表达缺失率分别明显高于年龄≤50岁、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。晋薇等[18]研究显示，高FIGO分期、深肌层浸润以及有淋巴结转移的子宫内膜癌患者MMR蛋白表达缺失率较高。本研究结果显示，MMR蛋白表达缺失均发生在子宫内膜腺癌患者中，不同FIGO分期、浸润深度子宫内膜癌患者中MMR蛋白表达缺失率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），与上述研究结果不同，可能与人种和地域因素有关。本研究结果还显示，低分化子宫内膜腺癌患者中MMR蛋白表达缺失率明显高于中分化和高分化子宫内膜腺癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

MSI是由于机体MMR系统丧失导致复制错误的结果，常见于遗传性肿瘤，在散发性肿瘤中也存在一定比例的MSI阳性率。有研究报道，MSI与患者性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及肿瘤浸润深度均无相关性。彭俊玲等[19]研究发现，MSI与散发性结直肠癌患者的年龄有关；而赵岩等[20]研究显示，子宫内膜癌组织中MSI与肿瘤分期、淋巴结转移、肌层浸润深度无关，但MSI更倾向发生于分化程度高及子宫内膜腺癌组织中。本研究结果显示，年龄＞50岁子宫内膜癌患者的MSI阳性率高于年龄≤50岁的患者，子宫内膜腺癌患者的MSI阳性率高于非子宫内膜腺癌患者，低分化子宫内膜腺癌患者的MSI阳性率低于中分化和高分化子宫内膜腺癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同FIGO分期、浸润深度、淋巴结转移情况子宫内膜癌患者的MSI阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

研究认为，MMR蛋白表达缺失的患者往往预后较好，其可能的机制为MMR蛋白表达缺失的组织中，微卫星序列突变率上升，进而促进机体产生新的肽段，而其中一些肽段作为新抗原可被机体免疫系统识别并处理，从而增强机体的免疫应答，导致免疫细胞尤其是T淋巴细胞浸润增多[21]。已有研究发现，在结直肠癌以及非小细胞肺癌中，具有MMR蛋白表达缺失的患者淋巴细胞浸润有所增加[9]，而MSI与MMR蛋白表达缺失密切相关[19-20]。张学华等[22]研究发现，MMR蛋白表达缺失子宫内膜癌患者中CD4+的水平显著高于MMR蛋白表达未缺失的患者。本研究结果显示，MMR蛋白表达缺失患者的CD4+、CD8+水平均明显高于MMR蛋白表达未缺失的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。MSI阳性患者中MMR蛋白表达缺失率为88.24%，明显高于MSI阴性患者的21.54%，差异有统计学意义（P＜0.01）。说明MMR蛋白表达缺失的子宫内膜癌组织中有大量免疫细胞浸润，患者的免疫功能有所提高，而MMR蛋白表达缺失可能参与MSI的发生，提示其可作为评价子宫内膜癌预后的指标。然而，本研究具有一定的局限性，样本量较小，且未对不同缺失蛋白的病例进行分层分析。因此，仍需加大样本量进行进一步研究。

综上所述，MMR蛋白在子宫内膜癌的发生发展中具有重要作用，年龄＞50岁、低分化、有淋巴结转移的子宫内膜癌患者中MMR蛋白表达缺失率较高。MMR蛋白表达缺失的组织中有大量免疫细胞浸润，患者的免疫功能有所提高。