环氧化酶-2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9在非小细胞肺癌中的表达及意义

刘东雷，吴恺，吉浩哲，兖克达，王清清

郑州大学第一附属医院胸外科，郑州 450000

非小细胞肺癌是临床常见的肺癌类型之一，发病率高，病死率增长迅速，严重影响患者生命安全。非小细胞肺癌占所有肺癌的75%～80%，而且由于肺癌患者早期临床体征不明显，肺癌的侵袭与转移具有隐匿性，对开展临床治疗产生了较大的影响[1]。研究显示非小细胞肺癌具有向周围组织浸润和远处转移的特点，而且即使开展临床治疗仍具有较高的复发率。随着现代医学的飞速发展，越来越多的研究向分子生物学机制发展，基质金属蛋白酶属于人体重要的酶类，可以特异性地降解细胞外基质和基底膜，因此一直被认为是肿瘤侵袭与转移过程中重要的金属蛋白酶之一；环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）则是常见的限速酶，可以催化花生四烯酸转变为前列腺素与血栓素，对肿瘤微环境具有改变作用，而且在促进肿瘤血管形成方面具有重要意义[2]。本研究分析了COX-2、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）在非小细胞肺癌中的表达及意义，以期为临床提供指导和依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年1月至2018年12月郑州大学第一附属医院收治的非小细胞肺癌患者的病历资料。纳入标准：①均经病理学确诊为非小细胞肺癌；②术前未行放化疗等抗肿瘤治疗；③临床资料保存完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤。根据纳入、排除标准，共纳入78例非小细胞肺癌患者，其中男性40例，女性38例；年龄35～81岁，中位年龄59岁。取78例患者的非小细胞肺癌组织，同时选取癌旁组织（距肿瘤边缘＞5 cm）作为对照。

1.2 检测方法

采用免疫组化法测定COX-2、MMP2、MMP9浓度变化，试剂均购自上海蓝怡科技股份有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。制作石蜡切片，烤片待用，常规二甲苯脱蜡并水化，阻断灭活内源性过氧化酶，随后进行抗原修复，采用柠檬酸缓冲液作为抗原修复液，在切片中加入10%正常山羊血清封闭降低背景，清除血清后甩去磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），加入0.04%二氨基联苯胺和0.03%过氧化氢溶液进行显色，在显微镜下控制染色深度，双蒸馏水冲洗终止染色，苏木素复染30 s，双蒸馏水冲洗数次后进行脱水透明，随后在镜下进行观察。

1.3 结果判断

参照Fromowitz等[3]提出的标准，随机选取5个视野，每个视野读取100个细胞，对染色强度和阳性细胞（着色部位均主要为细胞质）比例进行评分。染色强度：未染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度和阳性细胞比例得分之和≥4分为阳性表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman秩相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌组织和癌旁组织中COX-2、MMP2和MMP9阳性表达情况的比较

非小细胞肺癌组织中COX-2、MMP2和MMP9阳性表达率均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 非小细胞肺癌组织和癌旁组织中COX-2、MMP2和MMP9阳性表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织中COX-2、MMP2和MMP9表达情况的比较

腺癌、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化的非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织中COX-2阳性表达率分别明显高于鳞状细胞癌、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化患者，差异均有统计学意义（χ2=6.760、13.271、21.231，P＜0.01）；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织中MMP2阳性表达率分别明显高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（χ2=7.371、18.992、12.570，P＜0.01）；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织中MMP9阳性表达率分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（χ2=4.144、7.025、6.947，P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织中COX-2、MMP2和MMP9的表达情况（n=78）

2.3 相关性分析

COX-2与 MMP2、MMP9表达呈正相关（r=0.321、0.243，P＜0.05），MMP2与MMP9表达呈正相关（r=0.448，P＜0.05）。

3 讨论

非小细胞肺癌属于临床常见的肺部恶性肿瘤，目前发病率和病死率均位居榜首，近年来发病率呈逐年升高趋势，已成为威胁人类身心健康的重要问题之一。肺癌具有发病隐匿、侵袭性高等特点，因此早期诊断对降低肺癌病死率具有至关重要的意义。目前临床诊断肺癌的方法较多，包括临床症状检查、影像学检查、组织病理检查以及肿瘤标志物检测等方法，但是多数患者早期临床症状不明显，因此单纯依靠临床症状不具有特异性；影像学检查可以反映肿瘤病灶的大小和变化，但是无法对肿瘤细胞活动进行显现，而且在微小病灶的检出上效果一般[4]；病理学检查一直是临床肺癌诊断的金标准，特异度较高，但是具有创伤性，而且受到组织类型以及标本留取等多种因素影响，患者常无法接受，在早期诊断和评价治疗效果方面具有局限性[5]。近年来随着现代医疗技术的飞速发展，在分子生物学和免疫学领域发现细胞在癌变以及发生发展过程中会分泌活性物质，主要存在于肺癌组织和体液中，通过技术手段检测其在肿瘤患者体内的含量可评价患者治疗效果，为早期诊断和评估预后奠定了基础[6]。研究发现非小细胞肺癌患者存在明显的个体性差异，因此近年来个体化治疗根据肺癌患者药理学以及基因学特点采用最佳治疗方法，提升临床疗效，延长患者生存时间，分子生物学标志物的应用可以评估患者治疗后是否具有更高的复发和死亡风险，为临床调整治疗方法奠定了基础[7]。近年来寻找诊断肺癌的特异性标志物是临床研究的热点，大量研究证实细胞凋亡在肿瘤发生发展中起到了重要作用，凋亡是人体正常细胞维持稳定的重要保护机制，细胞凋亡参与了人体器官发育以及功能维持，肿瘤的发生则正是细胞凋亡紊乱导致，细胞凋亡过程被抑制以及基因的改变造成细胞转化突变，最终演变成为恶性肿瘤的发生和进展[8]。

本研究观察了COX-2、MMP2、MMP9在非小细胞肺癌患者体内的变化情况，环氧化酶属于分解花生四烯酸形成内源性前列腺素的限速酶，对于肿瘤多种生物学行为具有调控作用，COX-2属于重要的同功酶之一，一般在静息状态下不表达，当细胞被各种因子刺激时会快速合成，参与肿瘤发生发展等病理过程，最早在1998年有学者研究发现利用免疫组化法在非典型性腺瘤样增生组织及肿瘤细胞中发现COX-2蛋白表达明显增加[9]。目前大量研究证实一方面COX-2能够促进恶性肿瘤细胞增殖，同时还可以抑制肿瘤细胞发生凋亡[10]；另一方面COX-2可以促进恶性肿瘤血管形成，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力，还可以参与致癌物质代谢过程[11]。还有学者指出COX-2在肿瘤新生血管和转移病灶的血管中均表达，可以通过人体多种信号转导途径上调体内血管内皮生长因子的表达，促进了淋巴血管形成，还可以通过增加血管源性趋化性细胞因子表达促进非小细胞肺癌发生和发展[12]。随着分子生物学的研究进展，细胞外基质变化与调节作用在肿瘤发生发展过程中也越来越受到关注，细胞外基质分泌后在基底膜与细胞间质之间构成网架结构，可以为肿瘤的形成和发展提供组织保障，因此越来越多的研究关注基质成分变化，以指导临床诊断和治疗，基质金属蛋白酶家族在肿瘤生长过程中发挥着重要作用[13]。基质金属蛋白酶为钙离子、锌离子依赖性蛋白质水解酶，可以破坏细胞微环境稳态，破坏人体防御肿瘤侵犯的天然屏障，因此在肿瘤发生发展中起到关键作用[14]。MMP9属于基质金属蛋白酶家族成员之一，有研究指出基底膜肿瘤穿透基底膜、穿透血管的全过程均需要基质金属蛋白酶参与，其激活过程极为复杂，通过打破基质金属蛋白酶与其抑制因子之间的平衡关系发挥作用。一方面MMP9可以对胶原进行降解，激活其他类型基质金属蛋白酶，参与基质降解过程，促进了肿瘤生长，另一方面MMP9可以改建细胞外基质，破坏正常的基底膜结构导致肿瘤血管形成，因此在肿瘤发生和发展过程中具有重要作用。MMP2也是重要的Ⅳ型胶原酶，能够选择性降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原，其分布广泛，在组织与细胞出现癌变时表达明显升高，其分解Ⅳ型胶原酶过多会导致肿瘤细胞扩散和转移，而且其在肺癌组织中过度表达与患者病理分型、分化情况以及淋巴结转移关系密切，在肺癌发生发展过程中起到了重要的作用[15]。

本研究结果显示，非小细胞肺癌组织中COX-2、MMP2和MMP9阳性表达率均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义，说明在非小细胞肺癌中存在COX-2、MMP2和MMP9高表达。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织中MMP2、MMP9阳性表达率分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，说明MMP2和MMP9在不同临床分期、分化程度以及淋巴结转移方面存在差异性；腺癌、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化的非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织中COX-2阳性表达率分别明显高于鳞状细胞癌、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化患者，说明COX-2在不同肿瘤类型、临床分期、分化程度方面存在差异性。通过相关性分析发现，COX-2与MMP2、MMP9表达呈正相关，MMP2与MMP9表达呈正相关，说明三者在非小细胞肺癌患者表达中存在相关性。本研究优势在于证实了非小细胞肺癌患者体内存在COX-2、MMP2和MMP9过表达，为临床开展早期诊断和评估肺癌患者临床分期、肿瘤类型、转移情况、分化程度提供了一定的依据，但是本研究纳入患者数量有限，随访时间短，因此还需要开展多中心、大样本量、长期随访深入研究。

综上所述，非小细胞肺癌组织中COX-2、MMP2和MMP9表达明显升高，与临床特征有一定关系，三者间表达存在相关性。