高灵敏瑞利光散射法测定药物及人血中美司那

何树华，刘晓红，周清清，江 虹

(长江师范学院化学化工学院，长江师范学院武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆 408100)

美司那又名α-巯基乙基磺酸钠盐，为抗肿瘤类辅助药，对泌尿系统有特殊的保护作用。由于美司那结构中巯基(-SH)的存在，可以预防人体进行肿瘤化疗时，所用高剂量环磷酰胺所引起的出血性膀胱炎等泌尿系统的上皮毒性，可以去除环磷酰胺或异环磷酰胺所产生的毒性物质丙烯酸，且不干扰母体药物对肿瘤的化疗效果。但作为一种新型的抗毒剂，如用药过量时，可能使患者出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、过敏反应，或诱发低血压、心率加快，或肝转氨酶升高等副作用。为了合理用药，对美司那药物中的含量进行研究有着重要意义。

目前，国内外对美司那的检测方法研究很少，报道较多的方法是高效液相色谱法[1 - 7]，也偶见离子色谱法[8]、分光光度法[9 - 11]及电化学法[12]等的报道。高效液相色谱法除仪器偏贵不易普及外，还存在前处理烦琐、费时等不足。其它方法或灵敏度不够高或选择性欠佳或条件要求严格等。本工作采用高灵敏的瑞利光散射(RLS)技术，利用碱性艳蓝B与美司那之间的静电作用，建立了检测美司那的简便、快速、高灵敏的RLS新方法，尚未见文献报道。方法用于人体血液及药物中美司那的测定，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500型荧光分光光度计(日本，日立公司)；pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

美司那(Mesna，MSN；中国食品药品检定研究院)对照品溶液：164.2 mg/L(贮备液)，存于4 ℃冰箱；临用时取贮备液配成1.642 mg/L工作液。碱性艳蓝B(Basic Brilliant Blue B，BASB；上海源叶生物科技有限公司)溶液：1.0×10-4mol/L。B-R缓冲溶液：取适量0.04 mol/L H3PO4、H3BO3和HAc与适量0.2 mol/L NaOH溶液混合，用酸度计测定，配成pH=3.5～10.2的溶液。所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

样品：不同厂家生产的美司那注射液(1#和2#，市售只见这种剂型的药物)；人体血清(3#，长江师范学院校医院提供)。

1.2 试样溶液的制备

抽取1#和2#美司那注射液样品各1支，内容物分别置于1 000 mL容量瓶中，用水定容。准确移取该液5.00 mL置于另一1 000 mL容量瓶中，用水定容，即制得1#和2#待测液。取3#血清样品2.00 mL，加适量三氯乙酸，振摇，以4 000 r/min离心分离15 min，取上清液2.00 mL置于50 mL容量瓶中，用水定容，即为3#待测液。

1.3 实验方法

室温下，准确移取0～1.00 mL MSN标准工作液(或MSN试液)于10 mL比色管中，依次加入1.50 mL pH=9.25 B-R缓冲溶液和3.00 mL碱性艳蓝B溶液，摇匀后，用水定容。静置20 min，在荧光分光光度计上同步扫描瑞利光散射(RLS)光谱，测定最大RLS波长355 nm处体系和试剂空白的RLS强度IRLS及I0，再计算出ΔIRLS=IRLS-I0。

2 结果与讨论

2.1 MSN-BASB的光谱特征

图1为MSN、BASB及他们以静电作用相结合的RLS光谱图。可知，MSN自身几乎无散射，BASB自身有较弱的RLS信号，若在BASB溶液中加入pH=9.25 B-R缓冲溶液，则RLS信号显著增强(λmax=355 nm，IRLS=1 672)，在最大RLS峰的长波方向466 nm附近及555 nm处有相对较弱的散射峰。从图可知，当在BASB的碱性溶液中加入不同用量的MSN标准工作液后，由于BASB是一种阳离子染料，可与MSN结构中的-SO3H以静电引力作用结合成离子缔合物，使体系的摩尔质量增大，导致RLS增强，其增强强度ΔIRLS随着MSN用量的增大逐淅增强，当MSN处于一定浓度范围内时，其质量浓度与ΔIRLS呈线性关系，可用于MSN的定量分析。实验选用灵敏度最高的355 nm波长作为测定波长。

图1 MSN与BASB的RLS光谱Fig.1 RLS spectra of MSN and BASB1:0.164 mg/L MSN;2:3.00×10-5 mol/L BASB;3 - 8:0.0,0.0328,0.0657,0.0985,0.131,0.164 mg/L MSN-3.00×10-5 mol/L BASB;pH=9.25.

2.2 反应条件的选择

2.2.1 介质、酸度及用量室温下，取1.00 mL MSN标准工作液、2.00 mL BASB溶液，考察1.00 mL相同pH值的各缓冲溶液(HAc-NaAc、B-R、Tris-HCl)对MSN与BASB以静电引力结合生成的缔合物时ΔIRLS的影响。实验表明，使用B-R缓冲溶液时，RLS强度相对较大(ΔIRLS=788)，体系灵敏度较高，故选用B-R缓冲溶液作反应介质。相继考察了不同pH值的B-R缓冲溶液对MSN与BASB以静电引力结合生成的缔合物的ΔIRLS的影响，见图2。结果表明，在酸性范围内，缔合物受酸度影响小，在碱性范围内，pH值的大小对缔合物影响较大，最适酸度是pH=9.25。该条件下，体系的ΔIRLS相对最大，当大于或小于pH=9.25时，体系灵敏度均有不同程度降低。考察pH=9.25 B-R缓冲溶液的用量对缔合物ΔIRLS的影响时，实验表明，用量在1.50～2.50 mL范围内，ΔIRLS较大且基本不变。故实验选用pH=9.25 B-R缓冲溶液1.50 mL来控制反应的酸度。

图2 pH对ΔIRLS的影响Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLSMSN:0.164 mg/L;BASB:2.0×10-5 mol/L.

2.2.2 BASB用量或浓度室温下，取1.00 mL MSN标准工作液、1.50 mL pH=9.25 B-R缓冲溶液，考察0.50～4.00 mL BASB溶液对MSN与BASB以静电引力结合生成的缔合物的ΔIRLS的影响，见图3。曲线表明，当BASB的用量在2.80～3.20 mL范围内(或体系溶液中BASB的浓度在2.8×10-5～3.2×10-5mol/L范围内)时，ΔIRLS相对较大，实验选用灵敏度最佳的BASB用量3.00 mL或体系溶液中最佳BASB浓度3.0×10-5mol/L。

图3 BASB浓度对ΔIRLS的影响Fig.3 Effect of BASB concentration on ΔIRLSMSN:0.164 mg/L;B-R:pH=9.25,1.50 mL.

2.2.3 试剂加入顺序室温下，取1.00 mL MSN标准工作液及上述选定条件下的B-R缓冲溶液和BASB溶液，考察他们的加入顺序对MSN与BASB以静电引力结合生成的缔合物的ΔIRLS的影响。实验表明，ΔIRLS相对最大的试剂加入顺序为：MSN溶液、B-R缓冲溶液、BASB溶液。故实验选择用最佳的试剂加入顺序进行各项实验。

2.2.4 时间及稳定性室温下，取1.00 mL MSN标准工作液，在上述选定实验条件下，考察MSN与BASB的反应时间对其以静电引力结合生成的缔合物的ΔIRLS的影响。实验表明，MSN与BASB的静电相吸作用在20 min内，随着反应的进行，ΔIRLS逐淅增大，20～80 min内，ΔIRLS达最大且基本不变。由此说明，MSN与BASB的反应在20 min内可进行完全，稳定时间至少1 h。故实验选在20 min后进行测定。

2.3 ΔIRLS与MSN的关系

分别取MSN标准工作液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL具塞比色管中，按选定的实验条件加入其它试剂溶液，再按1.3的方法测定标准系列溶液的RLS增强强度ΔIRLS。以ΔIRLS为纵坐标，MSN的质量浓度为横坐标，作ΔIRLS-c标准曲线。MSN在0.005～0.16 mg/L范围内与ΔIRLS呈线性关系，线性方程为：ΔIRLS=-15.79+5372c，相关系数r=0.9993，检出限为0.0046 mg/L。

2.4 共存物质的影响

2.5 样品测定

准确移取1.2下的1#待测液0.30 mL、2#待测液0.20 mL、3#待测液1.00 mL，按1.3的测定方法配制溶液并同步扫描RLS光谱，各做6份平行测定。根据谱图上RLS强度及回归方程即可求出各待测液中MSN的含量，从而求得原始MSN样品中MSN的含量。最后做3水平的加标回收试验，各水平做6份平行测定，依据实验结果即可判断方法的准确度和精密度。结果见表1。

表1 美司那样品分析结果及回收试验(n=6)

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3 结论

用本文建立的瑞利光散射法测定美司那，简便、快速并有高的灵敏度(4.8 ng/L)、准确度(回收率为98.3%～102%)和精密度(RSD为1.8%～2.5%)，满足痕量分析要求。样品处理简单、安全，所用仪器为普通荧光分光光度计易于普及，所用试剂为一般的分析纯易于采购。本方法可用于市售MSN药物及人体血液样品中MSN的定量分析。