基于超高效液相色谱-飞行时间-高分辨质谱的林泽兰内酯B在大鼠体内代谢研究

秦伟瀚，李晓明，阳 勇，李 卿*

(重庆市中药研究院，重庆 400065)

野马追为菊科植物轮叶泽兰(EupatoriumlindleyanumDC.)的干燥地上部分[1]，为2015年版《中国药典》所收录[2]。本品味苦、性平，归肺经，具有化痰、止咳、平喘之功效，常用于治疗痰多、咳嗽、气喘等病症[3，4]。化学成分研究表明，野马追主要含有黄酮、生物碱、萜类、甾醇类等成分[5 - 9]。林泽兰内酯B属于愈创木烷型倍半萜，是野马追的主要生物活性物质[10]，且含量颇高。目前尚无林泽兰内酯B药效、毒性的相关文献报道，对其研究稍显迟滞。因此，研究林泽兰内酯B及其代谢产物，明确其药效物质基础，对于中药材野马追的临床使用和新药开发等具有重要意义。

超高效液相色谱-飞行时间-质谱(UPLC-Q-TOF-MS)联用技术可以提供良好的分离效果及强大的结构表征能力，已广泛运用于中药复杂成分研究，以及环境分析、中药代谢、药物分析等领域，不仅可以避免繁琐、耗时的分离纯化过程，而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量药物及代谢物[11 - 15]。本研究以探究大鼠血清中林泽兰内酯B的代谢产物为目标，采用高分辨质谱，基于多重质量亏损和动态背景扣除技术，系统分析了林泽兰内酯B在大鼠体内的生物转化过程，为明确中药材野马追的药效物质基础及深入开发利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

LC-30A型超高效液相色谱仪(日本，岛津公司),附二元高压泵、自动进样器、柱温箱；Triple TOFTM4600型四极杆串联飞行时间-高分辨质谱仪(美国，AB公司)，附Analyst1.6工作站、PeakView 1.2.0.3数据处理软件、MetabolitePilot 1.5.0.8532代谢产物鉴定软件；DW-86L486型超低温冰箱(中科美菱公司)；Microfuge 20R型超高速离心机(美国，贝克曼库尔特公司)。

林泽兰内酯B对照品为自制，经高效液相色谱(HPLC)归一化法测定，纯度>98%。乙腈、甲醇、水(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国ACS公司)。

1.2 实验动物及林泽兰内酯B灌胃给药

SD大鼠，SPF级，10只，雄性，体重200±20 g，由重庆市中药研究院实验动物研究所提供(实验动物生产许可证号：SCXK(渝)2012-0006，动物合格证号：0003054)。动物饲养于重庆市中药研究院药化所，动物实验环境(温度20～25 ℃，湿度50%～65%)。自由摄食和饮水。饲养3 d后禁食12 h，自由饮水。按照5 mg/kg剂量灌胃，分别于给药后30、60、90、120、180、240 min眼眶静脉取血0.5 mL，置于装有肝素钠的EP管中，以12 000 r/min离心10 min后，取上层血清，于-80 ℃冰箱保存，备用。

1.3 样品采集与处理

按照采血时间点，精密吸取10只大鼠血清样品各50 μL，置于1.5 mL EP管中，加入甲醇100 μL后，涡旋混匀2 min，12 000 r/min离心10 min，分别吸取上清液和空白对照液2 μL，进行UPLC-TOF-MS分析。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度程序：0～1.0 min，5%B；1.0～11.0 min，5%～85%B；11.0～12.0 min，85%B；12.0～12.1 min，85%～5%B；12.1～15.0 min，5%B；流速：0.2 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：2 μL。

1.4.2 质谱条件电喷雾离子源，负离子扫描(ESI-)模式采集数据，喷雾电压(IS)：-4 500 V；雾化气压力(GS1)：0.31 MPa；气帘气压力(CUR)：0.14 MPa；辅助气压力(GS2)：0.34 MPa；离子源温度：650 ℃；簇裂解电压(DP)：50 V；碰撞能量(CE)：45 eV；检测模式为信息关联采集模式(IDA)，多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)为触发二级质谱的条件，满足该条件优先进行二级质谱扫描。

1.5 代谢产物分析鉴定

采用ChemDraw软件建立林泽兰内酯B的mol格式文件，导入PeakView软件，结合Formula Finder、Mass Calculators等功能，对林泽兰内酯B标准品及含药血清样品进行定性分析，并将上述结果代入MetabolitePilot软件，对林泽兰内酯B入血后产生的所有代谢产物进行分析鉴定。

2 结果与讨论

2.1 林泽兰内酯B鉴定分析

采用UPLC-TOF-MS对林泽兰内酯B样品进行分析。如图1、图2所示，林泽兰内酯B在ESI+模式中的母离子[M-H]-为m/z359.1496，经质谱电离裂解作用分别脱去116.0496 Da、244.1125 Da生成了m/z为243.1000、155.0371的碎片离子，再m/z243.1000的碎片离子脱去43.9907 Da生成m/z199.1093的离子，利用PeakView软件的Mass Calculators功能计算出C5H8O3、C15H16O3、CO2的理论值分别为116.04680 Da、244.10940 Da、43.98928 Da，与脱去碎片的实际值之差均小于0.01 Da。通过上述对二级碎片裂解规律的分析并结合化合物结构特点，判定该化合物即为林泽兰内酯B。

图1 林泽兰内酯B的提取离子色谱图和二级质谱图Fig.1 Extraction ion Chromatograms(XIC) and MS/MS of eupalinilide B(a) XIC of standard product;(b) MS/MS of standard product;(c) XIC of serum;(d) MS/MS of serum.

图2 林泽兰内酯B裂解规律图Fig.2 Pyrolysis chart of eupalinilide B

将林泽兰内酯B分子式(C20H24O6)代入PeakView软件的XIC Manager筛查表中对该化合物保留时间、强度等质谱参数进行提取处理；由图1a、1c可知，标准品在5.931 min处有超过100 000 cps响应，而血清样品在5.939 min处有接近20 000 cps响应，进一步对其MS/MS碎片进行比较分析(如图1b、1d)，发现两者的裂解碎片的m/z基本一致，据此判断血清样品中含有林泽兰内酯B。由数据处理结果可知，入血后离子强度为灌胃标准品的1/5，表明林泽兰内酯B的生物利用度较高，该类化合物应有较高的开发利用价值。

2.2 林泽兰内酯B大鼠体内代谢转化分析

采用ChemDraw软件建立林泽兰内酯B的mol格式文件，导入MetabolitePilot软件中，获取该化合物理论裂解参数，再将标准品的Q-TOF数据作为血清样品的参比对照导入该软件，以2.1项下的保留时间、二级碎片等分析结果对林泽兰内酯B实际质谱信息进行筛选匹配，建立该化合物的质谱数据库；MetabolitePilot软件会自动对以林泽兰内酯B为母核的所有代谢产物进行分析处理，再结合相应代谢产物的二级碎片进行补充鉴定，代谢产物鉴定结果见表1、图3。

表1 林泽兰内酯B代谢产物鉴定结果

(续表1)

图3 林泽兰内酯B代谢过程图Fig.3 Metabolic process diagram of eupalinilide B

通过大鼠体内生物转化分析研究，以林泽兰内酯B为原型共鉴定出了26种代谢产物，其中Ⅰ相代谢包括氢化、氧化、水解、成酮、脱氧、甲基化等8种反应类型；Ⅱ相代谢包括葡萄糖苷结合、葡萄糖醛酸结合、乙酰化、磷酸化、谷胱甘肽结合、谷氨酰胺结合共6种反应类型；有15种代谢产物发生水解反应，可见水解是主要代谢过程，与化合物原型含有1个酯键和1个内酯的结构特征相符；Ⅰ相代谢中氧化反应较多，可以是加氧、成酮或成羧酸，而还原反应以不饱和双键加氢为主；单独的Ⅱ相反应只有谷胱甘肽结合(M10)、葡萄糖醛酸结合(M8)，其余4个发生了结合反应的Ⅱ相代谢产物均伴随了Ⅰ相水解反应。由此可见Ⅰ相反应过程通过氧化、还原、水解在林泽兰内酯B分子结构中引入或脱去功能基团从而发挥药效活性或失去活性；Ⅱ相反应则通过与内源性物质经共价键结合，生成极性大、水溶性高的结合物，经尿液排泄。

2.3 林泽兰内酯B量时变化分析

由量时曲线(图4)可以看出，当采血时间为灌胃后30 min时，血清样品中林泽兰内酯B峰面积达到最大值为94 500；当采血时间为60 min时，林泽兰内酯B的峰面积稍有降低为76 095；而在90 min时，峰面积降低至最大值的一半(50 030)；之后直到240 min血清样品，林泽兰内酯B峰面积仅小幅波动，可能与药物吸收代谢特性及血清样品的基质效应有关。通过量时变化趋势分析，初步探讨发现，林泽兰内酯B生物利用度较高，该成分与药效活性密切相关。

图4 林泽兰内酯B量时曲线图Fig.4 Mass spectrometric response intensity and time curve of eupalinilide B

3 结论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术，基于多重质量亏损和动态背景扣除技术，结合PeakView、MetabolitePilot软件，对林泽兰内酯B在大鼠体内的生物过程进行系统分析，共鉴定出24种代谢产物，其中Ⅰ相水解反应是主要代谢过程；在采血时间为30 min的时候，林泽兰内酯B的离子强度达到最高值，之后逐渐降低，初步探讨发现，林泽兰内酯B生物利用度较高，该成分与药效活性密切相关，课题组拟在后期对该活性成分进行药代动力学深入分析。野马追的主要化学成分包括黄酮类、萜类、生物碱、甾醇类等，其中林泽兰内酯B是属于愈创木烷型倍半萜类的一种，是野马追主要特征有效成分。本研究在对林泽兰内酯B化学结构进行定性解析的基础上，采用MetabolitePilot软件对林泽兰内酯B的所有代谢产物进行快速分析鉴定，极大简化了中药复杂成分、复杂代谢过程的数据处理流程，为明确野马追的体内起效物质基础提供了新思路，也为野马追的新药开发及临床应用等提供科学参考。