古菌脂质的前处理方法比较及超高效液相色谱-高分辨质谱分析

王小雪, 何祉安, 李 欣, 宋庆浩, 邹欣薇,4, 宋雪瑶,4, 冯 蕾*

(1. 上海交通大学药学院, 上海 200240; 2. 上海交通大学分析测试中心, 上海 200240; 3. 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室, 上海 200240; 4. 上海交通大学农业与生物学院, 上海 200240)

古菌是一类兼具真菌及细菌细胞特征的单细胞微生物,大多生活在高盐、极酸、极热、厌氧等极端环境下[1]。有研究[2]表明,古菌的膜结构及脂质代谢通路具有特异性,使其可在极端环境下进行正常的代谢活动。超嗜热嗜压古菌的单不饱和脂肪酸含量显著高于其他微生物[2];细胞膜中的磷脂分子与脂肪酸链的键合方式并非酯键而是通过醚键相连[3],特殊的结构可能与该类古菌细胞膜耐压有关。此外,古菌中有甘油二烷基甘油四醚(GDGT)等特殊脂质,GDGT作为重要的分子化石,对生态学和海洋学的研究具有重要意义[4]。近年来,对古菌的脂质研究大多集中在对这些特殊脂质的分析上,而对古菌总脂质的分析却鲜有报道。作为古菌脂质的重要组成部分,对古菌中的非特殊脂质(常规脂质)含量及相关代谢通路进行探索,不仅可以全面了解古菌脂质成分,还可以深入地研究古菌非特殊脂质及特殊脂质代谢之间的关系,并发现可能的转化通路,从脂代谢的角度探究古菌适应极端生长环境的机理。因此,研究古菌脂质的成分和含量对阐明古菌脂代谢和古菌特殊的生理特性具有重大的科学意义[5]。

超高效液相色谱-质谱联用技术因灵敏度高、样品损耗小、前处理简便、检测范围广,在非靶向脂质组学中得到广泛应用[6-8]。在分析过程中,样本前处理是脂质组学分析的第一步,对脂质的检测范围、鉴定准确性及重复性均有显著影响[9,10]。近年来,有许多优秀综述对常见的脂质提取方法进行了详细归纳和总结[11]。其中应用最为广泛的为液液提取法和固相提取法。液液提取法因经济实惠、操作简单而被广泛应用,其中最为常见的有Folch法、Bligh-Dyer加酸法和甲基叔丁基醚(methyltert-butyl ether, MTBE)法[12-14]。

Folch法是指用氯仿和甲醇作提取剂(体积比2∶1),并用水萃取除杂的脂质提取法[15]。该方法可高效提取大部分脂质,在脂质提取方法中被称为脂质提取的金标准;然而该方法对强极性磷脂的提取效果较差[16,17]。

Bligh-Dyer加酸法在Folch法的基础上,调整氯仿和甲醇的体积比为1∶2,并在水相中加入了盐酸,提高了酸性磷脂等极性脂质的提取效率,也是在古菌的脂质提取中最广泛采用的方法。然而该方法步骤复杂、提取时间较长,导致提取重复性较差[10]。

MTBE法使用甲基叔丁基醚(MTBE)为提取剂,由于MTBE密度小,脂质提取层为上层,易于收集提取液,因此提高了方法的重复性。但该法对极性较大的磷脂的提取效果欠佳[18]。

最近,随着固相萃取(solid phase extraction, SPE)法的不断开发,它也越来越多地应用于提取脂质。不同于液液提取法,SPE法可以通过选择不同规格和性质的填料,特异性地吸附目标脂质,针对性强,兼具富集和除杂的作用[19]。随着96孔板式SPE分离材料的商品化,还可满足高通量的需求,特别适用于组学及大样本分析[20]。目前SPE处理细胞脂质的应用主要集中于对低丰度脂质或特定脂质的富集和除杂[21,22]。但随着SPE技术的不断发展,已有文献[23]报道,利用沃特世商品化的96孔板式Ostro SPE去磷脂板提取血浆样品的总脂。

表1总结了常见的微生物脂质提取方法的应用范围。目前,国内对脂质提取方法的研究大多专注于血浆样本[24],尚未有报道详细比较并评价每种方法在微生物全脂质提取中的差异,而针对喜好极端环境的古菌脂质提取方法的研究,更未有报道。因此,本文以嗜热嗜压古菌Pyrococcusyayanosii为模式生物,利用单因素方差分析、提取效率比较、重复性比较和提取歧视性分析等方法,对Bligh-Dyer加酸法、Folch法、MTBE法及SPE脂质提取方法进行评价,结合超高效液相色谱-高分辨质谱联用(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)技术,为古菌和其他极端微生物的脂质研究和检测分析提供方法依据。

表 1 已报道的微生物脂质提取方法

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

甲醇(LCMS级)、乙腈(LCMS级)、异丙醇(LCMS级)试剂购自美国赛默飞世尔科技有限公司;氯仿(色谱级)、二氯甲烷(色谱纯)、三氯乙酸(色谱级)、甲基叔丁基醚(色谱级)购自德国CNW科技有限公司;Ostro SPE去磷脂板购自美国沃特世科技有限公司。

Hermle Z383K型高速冷冻离心机(德国Hermle仪器科技有限公司); KQ-500B型超声波清洗器(上海精密仪器仪表有限公司); JXFSTPRP-Ⅱ液氮冷冻研磨机(上海净信科技有限公司); RVT4104-230离心浓缩仪(美国赛默飞世尔科技有限公司); Vanquish UHPLC-QE plus液相色谱-质谱联用仪(美国赛默飞世尔科技有限公司); BEH C18色谱柱(30 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美国沃特世科技有限公司)。

1.2 菌株培养与收集

根据文献[30]报道,利用TRM培养基培养超嗜热嗜压古菌P.yayanosii,厌氧高温(95 ℃)条件下培养12 h,古菌达到生长对数期时终止培养。

将50 mL菌液倒入离心管并立即置于液氮中淬灭。淬灭后在4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min,弃上清,收获菌体。加入3%的氯化钠等渗溶液清洗残留的培养基,反复3次。

1.3 脂质提取

1.3.1Bligh-Dyer加酸法

加入Bligh-Dyer加酸法提取试剂(甲醇-二氯甲烷-5%三氯乙酸,2∶1∶1, v/v/v)2 mL后,再加入等体积的研磨珠,振荡研磨2 min破碎菌体。室温孵育30 min后加入二氯甲烷和5%三氯乙酸,使甲醇-二氯甲烷-5%三氯乙酸最终的体积比达1∶1∶0.8。涡旋后再次室温孵育30 min,离心取下层有机相。上述提取过程重复3次并合并有机相。

向有机相中加入超纯水2 mL,涡旋离心后取下层有机相,反复3次,除去残留的盐和酸,离心浓缩干后置于-80 ℃保存,待复溶上机。

1.3.2Folch法

向菌体中加入Folch法提取试剂(甲醇-氯仿,1∶2, v/v)10 mL后,加入与菌量相等的研磨珠,振荡研磨2min后,室温超声孵育1 h。涡旋离心后取下层有机相,反复提取3次后合并有机相。

加入2 mL的超纯水至提取液中,使提取液分层,涡旋离心后去下层有机相。反复萃取3次后,合并有机相。离心浓缩干后置于-80 ℃保存,待复溶上机。

1.3.3MTBE法

向菌体中加入MTBE法提取试剂(甲醇-MTBE, 3∶5, v/v)5 mL,加入研磨珠,振荡研磨2 min,室温孵育1 h后,加入超纯水1.25 mL,溶液分层。涡旋离心后取上层有机相。反复提取3次后合并有机相,离心浓缩后置于-80 ℃保存,待复溶上机。

1.3.4固相萃取法

向菌体中加入2 mL乙醇溶液,加入研磨珠,振荡研磨2 min后室温孵育20 min,涡旋离心取上清。将Ostro SPE去磷脂板用300 μL甲醇活化后加入提取液,使用正压装置收集穿出液并弃去。加入SPE洗脱剂(氯仿-甲醇-三乙胺,4.5∶4.5∶1, v/v/v)2 mL洗脱SPE柱,并收集穿出液,离心浓缩后置于-80 ℃保存,待复溶上机。

1.4 UPLC-HRMS分析条件

使用复溶剂(异丙醇-甲醇,1∶1, v/v)100 μL复溶样品,上机检测。流动相A为含10 mmol/L甲酸铵溶液和0.1%(v/v)甲酸的60%(v/v)乙腈溶液,流动相B为含10 mmol/L甲酸铵溶液和0.1%(v/v)甲酸的10%(v/v)乙腈异丙醇溶液,流速为0.4 mL/min。采用线性梯度,设定如下:0 min, 95%A; 5.5 min, 57%A; 12.0 min, 48%A; 12.5 min, 47%A; 22.5 min, 25%A; 23.5 min, 10%A; 26.5 min, 0%A。

质谱采用数据依赖型扫描(data dependent acquisition, DDA)模式采集数据。全扫描模式分辨率设定为70 000,自动增益控制(automatic gain control, AGC)为1×106,最大进样时间(maximum injection time, Maximum IT)设定为100 ms,扫描范围为m/z135至2 000。MS/MS模式分辨率为17 500, AGC为5×105, Maximum IT为50 ms,最小分辨率为m/z1.5,归一化碰撞能(normalized collision energy, NCE)为25、30、35。喷雾电压为3.2 kV (正离子模式)、3.0 kV (负离子模式),毛细管温度为320 ℃。

1.5 物质鉴定与数据分析

使用LipidSearch 4.2软件(赛默飞世尔科技有限公司/三井科技有限公司)对正、负离子模式数据进行搜库及碎片匹配。相关参数设置见表2。峰对齐后,将所有鉴定到的代谢物原始峰面积导出到Microsoft Excel,并根据以下预定的质量控制标准进行筛选:保留CV(生物样品3次重复进样的标准偏差/平均峰面积)低于0.3的物质;保留m-score(鉴定物质的碎片匹配程度)大于2.0的物质。

表 2 Lipidsearch数据库物质匹配参数设置

表 3 部分TG和DG的二级质谱结果

本研究中使用的统计方法主要有单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)和热图分析(heatmap analysis)。其中,ANOVA通常用于检验不同处理条件下多组之间是否存在显著差异。通过检验得到的P值可用于衡量代谢物在不同条件下的均值差异。热图分析是一种用颜色深浅程度表示代谢物含量的分析方法,该方法可对数据质量进行控制,并可以直观展示研究对象的差异变化情况。

本研究中使用SPSS软件(ver.19.0)进行单因素方差分析,使用在线分析网站(https:/ /software.broadinstitute.org/morpheus/)进行热图分析。

2 结果与讨论

2.1 几类脂质的质谱裂解规律

经UPLC-MS/MS对脂质组分进行检测,所得质谱数据与Lipidsearch标准谱库进行匹配,并结合母离子及二级特征碎片离子进行鉴定及结构确证。

2.1.1甘油酯的二级质谱解析

甘油三酯(TG)(18∶1/16∶0/16∶0)在ESI+模式下测得以下母离子:m/z850.785 6、855.755 8,判断分别为[M+NH4]+、[M+Na]+的加合形式(M代表中性分子式),对应的M为C53H100O6。

二级质谱(见图1)测得特征碎片离子m/z577.518 6、551.503 1,分别为[M-FA(16∶0)]+、[M-FA(18∶1)]+的碎片形式(FA指脂肪酸)。两个碎片的丰度比2∶1,与该结构中2个FA(16∶0)链和1个FA(18∶1)链相对应。根据该质谱裂解规律,共准确鉴定了212种甘油三酯、43种甘油二酯(DG)。部分代表性结果见表3。

图 1 TG(18∶1/16∶0/16∶0) [M+NH4]+离子的二级 质谱图及裂解途径Fig. 1 MS/MS spectrum of TG(18∶1/16∶0/16∶0) [M+NH4]+ion and fragmentation pathwayTG: triglyceride.

2.1.2鞘脂的二级质谱解析

神经酰胺(Cer)(d16∶0/23∶0)在ESI+模式下测得以下离子(见图2):m/z610.623 7,判断为[M+H]+的加合形式,中性分子式M为C39H79NO3。二级质谱图中测得特征碎片离子m/z592.602 4、256.263 1、238.252 6、226.252 8,分别为[M-H2O]+、[SPH(d16∶0)-H2O+H]+、[SPH(d16∶0)-2H2O+H]+、[SPH(d16∶0)-H2O-CH2O+H]+的碎片形式(SPH表示鞘氨醇)。根据该质谱裂解规律,共准确鉴定了118种鞘脂类物质,其中鞘氨醇碱类26种、神经酰胺类42种、鞘磷脂类30种、鞘糖脂类19种。部分代表性结果见表4。

图 2 Cer(d16∶0/23∶0) [M+H]+离子的二级 质谱图及裂解途径Fig. 2 MS/MS spectrum of Cer(d16∶0/23∶0) [M+H]+ion and fragmentation pathwayCer: ceramide.

表 4 部分鞘脂类物质二级质谱结果

2.1.3磷脂的二级质谱解析

磷脂酰胆碱(PC)(16∶0/13∶0)在ESI+模式下测得以下离子(见图3):m/z692.459 2,判断为[M+H]+的加合形式,中性分子式M为C37H74NO8P。二级质谱图中测得以下特征碎片离子m/z282.279 0、254.247 2、184.073 3、86.096 2,分别为[C18H34O2]+、[C16H30O2]+、[C5H14NO4P+H]+、[C5H14N]+的碎片形式。根据该质谱裂解规律,共准确鉴定了112种磷脂类物质,其中甘油磷酰胆碱43种、甘油磷酰乙醇胺36种。部分代表性结果见表5。

2.2 比较不同提取方法的提取效率

图4结果显示,4种提取方法在检测物质总数上无显著性差异,而Bligh-Dyer加酸法和SPE法中的高丰度物质(高丰度物质指对应色谱峰面积大于500 000的物质,这类物质易于获得高质量的MS/MS谱图用于结构解析)数目要显著大于Folch法和MTBE法(P<0.05)。采用这4种方法提取的脂质中高丰度脂质物质比例从大到小依次为SPE法>Bligh-Dyer加酸法>Folch法=MTBE法,显然SPE法在提取效率方面更具优势。

图 4 不同提取方法获得的脂类物质的数目Fig. 4 Numbers of lipids extracted by different methods BD: Bligh-Dyer acidic method. The vertical axis represents the number of identified substances in different peak response intervals. Black color represents the detected response interval above 500000. Dark gray represents the detected response interval from 10000 to 500000. Light gray represents the detected response interval less than 10000.

图 5 不同提取方法的提取重复性分析Fig. 5 The relative standard deviation of lipid metabolites by different pretreatments The vertical axis represents the number of identified substances in different intervals. Black color represents coefficient of variation (CV, n=3) is less than 10% among this group. Light gray color represents CV (n=3) between 10% and 20%. Dark gray color represents CV (n=3) between 20% and 30%. * indicates a significant difference (P<0.05).

2.3 比较不同提取方法的重复性

图5表明不同提取方法的重复性有显著差异。其中,SPE法和MTBE法重复性最好,二者无显著差别,有超过1 000种物质的重复性小于30%,符合代谢组学规定的相对标准偏差要求[31]。Folch法、Bligh-Dyer加酸法重复性较差。这两种方法在总数上虽无显著差异,但Bligh-Dyer加酸法的重复性不及Folch法。

图 6 不同提取方法提取(a)脂肪酸、(b)甘油酯、(c)甘油磷脂、(d)鞘脂的热图Fig. 6 Heatmap of (a) fatty acids, (b) glycerollipids, (c) phosphoglycerollipids, (d) sphingolipids with different extraction methods

SPE法利用商业化固相萃取小柱,整个过程为半自动化提取,人工操作步骤少,结果最稳定。MTBE法提取脂质时,有机相位于上层,与有机相位于下层的Bligh-Dyer加酸法和Folch法相比,有机相液层更方便取出,提取重复性更好。Bligh-Dyer加酸法由于操作步骤最多,重复性最差。

2.4 比较不同提取方法对各种脂质组分的提取效果

对不同方法提取鉴定到的各类脂质进行了单因素方差分析。结果表明,有显著性差异的物质(P<0.05)共54个,其中脂肪酸类有14个、甘油酯类12个、甘油磷脂类7个、鞘脂类13个、其他组分8个,说明不同提取方法在这些脂质的提取中有比较大的歧视性。

如图6a所示,在饱和脂肪酸提取中,Bligh-Dyer加酸法和SPE法效果优于其他方法;在不饱和脂肪酸提取中,MTBE法的提取效果最好,Folch法和Bligh-Dyer加酸法次之。如图6b所示,在甘油三酯和甘油二酯的提取中,SPE法效果最好,Bligh-Dyer加酸法次之,其次为MTBE法,Folch法最差。如图6c所示,在甘油磷脂类提取中,Bligh-Dyer加酸法和SPE法优于其他方法。

图 6 (续)Fig. 6 (Continued)

如图6d所示,在神经酰胺类和鞘氨醇类提取中,MTBE法最优,其次为Folch法,Bligh-Dyer加酸法和SPE法。在鞘磷脂中,SPE法与MTBE法优于Folch法和Bligh-Dyer加酸法。在二氢鞘氨醇中,SPE法最优,Bligh-Dyer加酸法次之,其次为Folch法和MTBE法。

综上,4种不同的提取方法均采用了极性和非极性混合溶剂处理,在脂质种类总数上无明显差异;在提取重复性方面,MTBE法和SPE法的提取重复性最好。Folch法中溶剂使用体积最大,而Bligh-Dyer加酸法步骤最多,提取得到的低浓度物质更多,一定程度上会降低鉴定和相对定量的准确性。

4种提取方法对各种脂质的提取结果表明,SPE法和MTBE法提取覆盖的脂质种类最多,更具有普适性。

因此,SPE法和MTBE法对总脂提取效果优于其余两种方法。由于SPE法需要大量使用商业化萃取柱,增加提取成本。因此可根据实际情况采用不同的方法。

2.5 P. yayanosii古菌样品脂质的提取与检测

采用SPE提取法,UPLC-HRMS技术检测P.yayanosii样品中的脂质成分,总离子流基峰色谱图见图7。

图 7 P. yayanosii古菌样品中脂质成分的UPLC-HRMS总离子流基峰色谱图Fig. 7 UPLC-HRMS base peak ion chromatogram of lipid substances extracted from P. yayanosii by SPE UPLC-HRMS: ultra-performance liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometry.

图 8 P. yayanosii脂质物质的组成Fig. 8 Lipid components of P. yayanosii Percentage equals current type of identified substances divided by the total number of identified substances.

结果表明,提取到的脂质种类丰富。利用该方法,在古菌P.yayanosii中共鉴定到1 402个常规脂类物质,鉴定到的各类常规脂质数目占所有鉴定数目的比例见图8。其中,鉴定到的脂肪酸的数目最多,占总数的27.35%;脂肪酸是甘油酯、甘油磷脂、鞘脂等其他类脂质的重要前体物质。鉴定到的甘油酯(18.69%)和甘油磷脂(17.05%)的数目其次;据报道,甘油磷脂与古菌耐压特性密切相关[32]。而鞘脂类和固醇类物质虽然鉴定到的数目较少,但作为重要的代谢通路参与者[33]也有重要意义。可见,本文使用的SPE全脂质提取方法可以覆盖到多种与脂质合成、耐压特性和脂质代谢相关的脂类物质,为古菌脂质代谢和特殊生理活性的研究提供重要的分析方法,具有重要意义。

3 结论

本文比较了Bligh-Dyer加酸法、Folch法、MTBE法和SPE法4种脂质提取方法对古菌脂质提取的效果,包括提取脂质总数、类别差异和提取重复性。虽然鉴定总数上4种方法无明显差异,但SPE法和MTBE法的重复性显著优于其他方法。SPE法和MTBE法对不同种类的脂质歧视性小,适用于古菌总脂质提取。通过SPE前处理法结合UPLC-HRMS的分析,最终在古菌P.yayanosii中测到1 402个常规脂类物质,以脂肪酸、甘油酯和甘油磷酯为主。本研究的实验结果不仅可以作为超嗜热嗜压古菌脂质提取的参考,同时也对其他极端微生物的脂质提取和UPLC-HRMS分有指导意义。