干酪乳杆菌16发酵豆乳工艺优化及抗氧化性研究

侯凯荣 妥彦峰 牟光庆

(大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034)

豆乳中含有丰富的营养物质，如大豆蛋白及不饱和脂肪酸等，对人体健康有益[1]。利用乳酸菌发酵豆乳，可将大豆中的异黄酮、蛋白质等物质进行适当生物转化，更利于人体吸收，具有增加免疫力、抗氧化等作用[2-3]。

唐宇等[4]研究发现干酪乳杆菌16发酵豆乳具有一定的抗氧化功能，主要是由于糖苷型大豆异黄酮转变为苷元型大豆异黄酮导致其抗氧化能力发生改变。徐寅等[5]发现发酵后豆乳的抗氧化能力较发酵前增强。Dajanta等[6]对发酵豆类进行研究发现，总酚含量与其抗氧化能力相关。孙晓琦等[7]发现乳杆菌发酵黄浆水可显著提高其抗氧化能力，且与总酚含量呈正相关。李彤等[8]采用植物乳杆菌发酵复合豆乳时，其游离氨基酸含量上升，且总抗氧化能力较发酵前有所增加。

在前期研究基础上，试验拟以总酚、游离氨基酸含量为指标，对L.casei16发酵豆乳工艺条件进行优化，并测定优化后发酵豆乳的总还原力和羟自由基清除能力，旨在为深入开发具有良好抗氧化功能特性的发酵豆乳提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

大豆：市售；

没食子酸、邻苯二甲醛、邻二氮菲：分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司；

MRS培养基：生物试剂，青岛高科园海博生物技术有限公司；

硫酸亚铁、三氯化铁：分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；

β-巯基乙醇、三氯乙酸、四硼酸钠、丙酮、过氧化氢、铁氰化钾：分析纯，天津市大茂化学厂；

福林酚：分子生物学级，大连美仑生物有限公司。

1.1.2 仪器与设备

物性仪：TA-XT plus型，英国超技公司；

全自动家用豆浆机：DJ11B型，九阳股份有限公司；

生化培养箱：FQC型，上海一恒科学仪器有限公司；

超净工作台：SWCJ1D2D型，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；

酶标仪：1510型，美国Thermo Fisher Scientific 公司；

精密pH计：S210型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

离心机：5804型，德国艾本德有限公司。

1.1.3 试验菌株

L.casei16：保藏号CCTCC M2018557，大连工业大学食品学院大连益生菌功能特性研究重点实验室提供，保藏于中国典型培养物保藏中心。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

大豆→浸泡→磨浆→冷却→接菌→发酵→冷藏→取样→测定

1.2.2 操作要点

(1) 室温下，按干豆与水重量比为1∶2泡发黄豆12 h，按干豆与水重量比为1∶4进行制浆，采用双层滤布对豆浆进行过滤，于高压蒸汽灭菌锅中105 ℃灭菌15 min。

(2) 菌种活化采用MRS液体培养基，以2%接种量将L.casei16连续活化3代(37 ℃，18 h)用于豆浆发酵。

1.2.3 单因素试验

(1) 发酵时间对发酵豆乳总酚、游离氨基酸含量的影响：豆乳灭菌处理后冷却至室温，以2%接种量接种L.casei16，37 ℃培养箱中分别发酵6，12，24 h，4 ℃条件下冷藏6 h。

(2) 冷藏时间对发酵豆乳总酚、游离氨基酸含量的影响：豆乳灭菌处理后冷却至室温，以2%接种量接种L.casei16，37 ℃培养箱中发酵24 h，4 ℃条件下分别冷藏6，12，24 h。

(3) 发酵温度对发酵豆乳总酚、游离氨基酸含量的影响：豆乳灭菌处理后冷却至室温，以2%接种量接种L.casei16，分别于37，40，43 ℃培养箱中发酵24 h，4 ℃ 条件下冷藏6 h。

1.2.4 正交试验设计 在单因素试验基础上，以发酵温度、发酵时间、冷藏时间为试验因素，以总酚和游离氨基酸含量为评价标准，采用L9(33)正交试验进行L.casei16发酵豆乳工艺条件优化。

1.2.5 物性指标检测 参照华晓曼等[9]的方法略作修改，利用物性仪进行硬度、稠度、内聚性、黏度指数测定。探头A/BE、测试速度1.00 mm/s、返回高度30.00 mm、测试距离15.00 mm、触发力5.00 g。

1.2.6 pH测定 采用pH计法。

1.2.7 总酚含量测定 参照王振帅等[10]的方法略作修改，取10 g发酵豆乳，加入10 mL 50% 丙酮，40 ℃振荡4 h，调节pH至4.5，1 500 r/min离心10 min，取上清液100 μL稀释至1 mL，分别加入福林酚0.5 mL，摇匀，加入12% Na2CO3溶液1 mL，用水稀释至12.5 mL，摇匀，避光反应2 h，测定765 nm处吸光值，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，其线性回归方程为y=5.105 1x+0.009 7，R2=0.996 9。

1.2.8 游离氨基酸测定 参照Xing等[11]的方法略作修改，取10 g发酵豆乳于50 mL离心管中，调节pH至4.5，静置20 min，4 ℃、3 000 r/min离心30 min。取50 μL上清液加入1 mL邻苯二甲醛试剂，室温反应2 min，测定340 nm处吸光度，以亮氨酸为标准物绘制标准曲线，其线性回归方程为y=1.294 7x+0.007 7，R2=0.996 8。

1.2.9 抗氧化活性测定

(1) 总还原能力：参照文献[12]。

(2) 羟自由基清除能力：参照文献[13]。

1.3 数据处理

所有试验均为3次重复，采用SPSS 2.0软件对试验数据进行统计分析，并采用Orgin 9.0软件绘图，字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间对发酵豆乳质构、pH、总酚和游离氨基酸含量的影响 由表1可知，物性指标均随发酵时间的延长而升高；pH值随发酵时间的延长而显著下降(P<0.05)。pH值的降低会导致发酵豆乳中的大豆球蛋白聚集凝结[2]，使分子间作用力不断加强，黏度、硬度增加[14]。随着发酵时间的延长，发酵豆乳中总酚、游离氨基酸含量均发生显著变化(P<0.05)，当发酵时间为24 h时，发酵豆乳中总酚、游离氨基酸含量达最大值，分别为15.56 mg/100 mL 和1.41 mg/mL。这是由于随着发酵时间的延长，发酵豆乳中蛋白质被L.casei16产生的酶逐渐水解，因此游离氨基酸含量较发酵前升高[15]。而且L.casei16将豆乳中复杂的大分子酚类物质转化为小分子酚类物质，释放出更多的酚羟基，故总酚含量较发酵前有所增加，与张琪等[16]的结果一致。

表1 不同发酵时间下发酵豆乳的性能指标

2.1.2 冷藏时间对发酵豆乳质构、pH、总酚和游离氨基酸含量的影响 由表2可知，发酵豆乳冷藏12 h与冷藏24 h的硬度无显著性差异；当冷藏时间为24 h时，发酵豆乳的稠度、内聚性和黏度指数均显著高于(P<0.05)其他冷藏条件下的。发酵豆乳的pH值随冷藏时间的延长无显著性变化，这是由于低温条件下，发酵豆乳中L.casei16生长速度降低，乳酸生成速度降低，发酵豆乳pH值呈相对稳定的状态[2]。当冷藏时间为12 h时，发酵豆乳中总酚含量最高，为14.53 mg/100 mL，与耿彪等[17]的结论一致。后期发酵豆乳中总酚含量下降可能是由于发酵豆乳中总酚发生氧化所致[18]。发酵豆乳中游离氨基酸含量随冷藏时间的延长先降低后升高，可能是冷藏12 h后，发酵豆乳中发生了其他化学变化，从而使游离氨基酸含量升高[19]。

表2 不同冷藏时间下发酵豆乳的性能指标

表3 不同发酵温度下发酵豆乳的性能指标

2.1.3 发酵温度对发酵豆乳质构、pH、总酚和游离氨基酸含量的影响 由表3可知，当发酵温度为37 ℃时，发酵豆乳硬度、稠度、黏度指数均达最高值。当发酵温度为30，37 ℃ 时，发酵豆乳pH值较低，发酵豆乳中的大豆球蛋白不断聚集凝结，进而导致硬度、稠度、内聚性、黏度指数发生变化，可能是此时发酵豆乳中L.casei16生长状态良好[2]，产酸能力较强，导致pH值较低。当发酵温度为43 ℃时，发酵豆乳中L.casei16的生长、产酸能力下降，体系中pH偏高。

由表3还可知，当发酵温度为43 ℃时，发酵豆乳中总酚含量显著增高(P<0.05)，可能是由于发酵温度的升高导致发酵豆乳中分子渗透、扩散、溶解速度加快，并且高温条件可以弱化或破坏细胞壁的完整性，使酚类物质更容易从发酵豆乳中转移至溶剂中，二者共同作用下导致了发酵豆乳中总酚含量的增加[20]；发酵豆乳中游离氨基酸含量随发酵温度的升高而显著升高。发酵过程中，Lactobacillus主要是由胞内肽酶(乳内肽酶、氨基肽酶等)降解寡肽从而产生游离氨基酸[21]。当发酵温度为43 ℃ 时，发酵豆乳中游离氨基酸含量最高，为1.04 mg/mL。刘璐[22]研究发现，鼠李糖乳杆菌1.0386的胞壁蛋白酶、氨肽酶的最适温度分别为40，45 ℃。推测发酵温度为43 ℃下游离氨基酸含量升高的原因可能是L.casei16发酵所产生的酶在43 ℃时保持良好活性。

2.2 正交试验

在单因素试验基础上，以总酚、游离氨基酸含量为考察指标，对发酵时间、冷藏时间、发酵温度进行正交试验以确定最优的发酵条件。试验因素水平见表4，结果与分析见表5。

表4 因素水平表

由表5可知，总酚含量的最优方案为A3B1C2，即发酵温度37 ℃，发酵时间24 h，冷藏时间6 h。游离氨基酸含量的最优方案为A3B3C2，即发酵温度37 ℃，发酵24 h，冷藏24 h。由表6可知，各因素对总酚、游离氨基酸含量的影响不显著(P>0.05)。

综合考虑上述两个正交试验结果的差异，如表7所示，方案A3B3C2的总酚含量高于方案A3B1C2，但差异不显著(P>0.05)，结合实际生产需求，确定最佳的发酵条件为A3B1C2，即发酵时间24 h，冷藏时间6 h，发酵温度37 ℃，此条件下发酵豆乳的总酚含量为13.94 mg/100 mL，游离氨基酸含量为1.33 mg/mL。陈佩等[2]发现，经24 h发酵后，L.caseiCCFM0412发酵豆乳中游离氨基酸含量上升，但低于试验结果，说明通过试验条件优化后，提高了发酵豆乳中游离氨基酸含量。

表5 正交试验结果及分析

表6 正交试验方差分析

表7 发酵豆乳优化方案验证实验

2.3 抗氧化能力比较

由表8可知，与未发酵豆乳相比，采用L.casei16发酵的未优化组和优化组豆乳总还原力分别为0.28，0.31，羟自由基清除能力分别为72.35%，79.43%，显著高于未发酵豆乳的(P<0.05)；优化后的发酵豆乳总还原能力和羟自由基清除能力得到显著提高(P<0.05)。Suo等[23]发现发酵乳杆菌Zhao发酵豆乳的羟自由基清除能力为55.1%，保加利亚乳杆菌发酵豆乳羟自由基清除能力为31.7%，均低于试验结果。

表8 抗氧化能力比较

3 结论

试验表明，发酵豆乳的最优工艺条件为L.casei16以2%接种量接种于豆乳，37 ℃发酵24 h，4 ℃冷藏6 h；该条件下发酵豆乳的总酚含量为13.94 mg/100 mL，游离氨基酸含量为1.33 mg/mL；优化条件下发酵豆乳的总还原能力为0.31，羟自由基清除能力为79.43%。后续将对L.casei16发酵豆乳的抗氧化机制进行研究。