形态学评分相近的单囊胚复苏移植选择策略

黎佩怡 陈志云

广东省惠州市中心人民医院生殖医学中心，广东惠州 516000

在体外受精-胚胎移植技术中，囊胚培养是世界公认筛选最具有活力胚胎的方法，对第三天胚胎行囊胚培养后移植可提高种植率和妊娠率[1]。此外，囊胚移植被认为可以更好地协调胚胎发育与子宫内环境的同步[2-3]。基于这些研究，选择性单囊胚移植逐渐成为一种保证高临床妊娠率并且降低多胎妊娠率的方法。自囊胚培养技术发展至今，由Gardner 和 Schoolscraft 建立的囊胚形态学评分标准被胚胎学家应用于挑选最有种植潜力的囊胚[4]。根据该评分标准，每一个囊胚的扩张程度分为1 ～6期，内细胞团和滋养层细胞则根据细胞的大小和紧密程度分为A、B、C 三级。但在囊胚形态学评分类似的情况下，如4AB 和4BA，临床医生和胚胎学家面对的问题是：哪个才是最佳囊胚？然而，对于优先考虑内细胞团还是滋养细胞层的评分，目前国内外研究尚无定论[5-6]。本研究探讨在复苏周期中如何选择形态学评分相近的单囊胚，为未来选择性单囊胚移植策略提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从本院生殖医学中心的辅助生殖管理系统数据库导出2014 年1 月～2020 年1 月进行的单个四期囊胚移植复苏周期共810 个，回顾性分析患者临床资料。患者纳入标准：（1）年龄＜40 周岁；（2）复苏后完全存活并在移植前扩张为四期的单个囊胚；（3）子宫内膜厚度为7 ～14mm。排除标准：（1）双囊胚移植；（2）新鲜囊胚移植周期；（3）囊胚复苏后有细胞裂解并导致评分降低的周期；（4）失访的移植周期。

1.2 囊胚培养

所有研究对象的超促排卵方案按本中心常规方法进行。在B 超引导下进行取卵手术，获卵后通过常规体外受精或单精子卵胞浆内注射进行授精。授精后第三天根据胚胎形态学评分进行新鲜胚胎移植或冷冻，患者签署知情同意书后剩余胚胎行囊胚培养。

1.3 囊胚形态学评分

本中心使用的囊胚形态学评分方法同Gardner 和Schoolscraft 的评分方法[4]。根据囊胚的扩张程度分为1 ～6 期，内细胞团和滋养细胞层的数量和形态分级为：A.细胞数目多且排列紧密；B.细胞数目较少且排列松散；C.细胞数目很少。

1.4 囊胚玻璃化冷冻与复苏

研究期间囊胚冷冻与复苏所使用的冷冻液、复苏液和载杆购买自瑞典Vitrolife 公司产品。囊胚冷冻之前通过激光进行人工皱缩，移入Vitri 1TM Blast 溶液中停留10min，再移入Vitri 2TM Blast 溶液中2min，在还有30s 结束时，将20μL Vitri 3TM Blast 溶液滴于无毒培养皿表面，当还有10s 结束时，收集囊胚并将其移至Vitri 3TM Blast 溶液液滴中，再将囊胚注入Rapid-iTM 载杆孔中，封口后移到液氮里保存。囊胚复苏时将Rapid-iTM 载杆取出并将其空洞置于Warm 1TM Blast 溶液中2min，将囊胚移至Warm 2TM Blast 溶液中3min，将囊胚移至Warm 3TM Blast 溶液中10min，将囊胚转移至相应的移植皿中等待移植。

1.5 复苏周期内膜准备与囊胚移植

患者提前进行自然周期或人工周期准备子宫内膜。囊胚复苏后2h 观察形态，囊胚腔重新扩张且评分不变的情况下，在B 超引导下行囊胚移植。

1.6 妊娠结局的判断

囊胚移植术后14 ～16d，电话随访其血清β-HCG 试验结果，若β-HCG 隔天快速下降且B超未见胎囊，可判断为生化妊娠；术后30 ～35d 行B 超检查，可见胎囊，判断为临床妊娠；若在妊娠12周内自然流产，判断为早期自然流产。

1.7 统计学方法

根据不同的统计类型，应用SPSS20.0 软件进行χ2检验或t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单个四期囊胚移植的妊娠结局

共复苏810 个周期，复苏率和存活率均为100%，移植前观察所有囊胚的囊胚腔均扩张为四期。其中435 例获得临床妊娠，临床妊娠率为53.7%，生化妊娠率为9.4%，早期流产率为14.9%。

2.2 形态学评分相近的囊胚对妊娠结局的影响

形态学评分相近的囊胚（4AB 组与4BA 组、4BC 组与4CB 组）患者的基本情况分析显示，年龄、BMI、基础FSH 水平、获卵数、授精方式、内膜厚度、复苏周期的内膜准备方案和D5/D6 囊胚比例的比较差异均无统计学意义（P ＞0.05）。见表1 ～2。4AB 组与4BA 组的妊娠结局分析显示，临床妊娠率（66.7% vs 66.1%）、生化妊娠率（4.2% vs 5.1%）和早期自然流产率（11.5% vs 10.8%）比较差异均无统计学意义（P ＞0.05），见表3。4BC 组与4CB 组的妊娠结局分析显示，4CB 组的临床妊娠率显著高于4BC 组（51.4% vs 39.7%，P=0.013），而生化妊娠率（14.1% vs 11.7%）和早期自然流产率（18.2% vs 18.9%）比较差异均无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。不同级别的内细胞及滋养细胞形态学评分见图1。

2.3 优质囊胚与非优质囊胚对妊娠结局的影响

优质囊胚组（4AB+4BA）和非优质囊胚组（4BC+4CB）的妊娠结局比较显示，优质囊胚组的临床妊娠率显著高于非优质囊胚组（66.6% vs 44.9%）、生化妊娠率（4.4% vs 12.9%）和早期流产率（11.4% vs 18.5%）均显著低于非优质囊胚组（P ＜0.05）。见表4。

3 讨论

3.1 囊胚形态学评分对妊娠结局的影响

随着体外囊胚培养体系的日趋成熟，囊胚培养成为了国内外大部分生殖医学中心的主要胚胎培养技术之一。在患者的可利用胚胎较多的情况下，临床医师和胚胎学家会建议患者进行囊胚培养，以筛选最有种植潜能的胚胎。通过形态学评分，将内细胞团和滋养细胞层的评分达到A/B 级的单个囊胚作为移植首选，已成为一种提高临床妊娠率和活产率的方法[1，7-8]。本研究选取了囊胚腔扩张程度为四期的单囊胚复苏移植周期，并在移植前扩张至四期，排除了囊胚腔扩张程度这一干扰因素，可更好的评价内细胞团和滋养细胞层的重要性。

表1 4AB和4BA单囊胚移植患者基本资料比较

表2 4BC和4CB单囊胚移植患者基本资料的比较

图1 不同级别的内细胞及滋养细胞形态（×400）

表3 四组囊胚的妊娠结局比较[n/n（%）]

3.2 形态学评分相近囊胚的选择策略

囊胚的内细胞团和滋养细胞层在胚胎发育和种植过程中各司其职，缺一不可。内细胞团发育为胎儿，滋养细胞层发育为胎盘。在单囊胚移植挑选中，如何选择形态学评分相近囊胚是临床医师和胚胎学家面对的日常问题。本研究表明，4AB 和4BA囊胚移植的妊娠结局相似，两组临床妊娠率均达到较高水平（均＞66%），而生化妊娠率和早期流产率较低。然而，4BC 和4CB 囊胚比较，4CB 囊胚的临床妊娠率显著高于4BC 组，并且生化妊娠率和早期流产率相仿。本研究结果显示，由于优质囊胚（4AB和4BA）的整体评分高，内细胞团和滋养细胞层均具有较高的种植潜力，因此4AB 和4BA 两组的妊娠结局相似。而对于非优质囊胚而言，滋养细胞层对临床妊娠的影响更大，提示滋养细胞层在囊胚种植早期阶段发挥重要作用相关。研究表明，只有囊胚种植在子宫内膜上，才有可能提供营养给胎儿后续的发育[9]。目前有关囊胚的内细胞团或滋养细胞层对预测妊娠结局的价值存在众多争议。国内学者汪彩珠等[10]报道在冻融单囊胚移植周期中，当囊胚评级≥BB 级时，因其临床结局相似，均可考虑施行单囊胚移植。夏梦等[5]的研究表明，相对于内细胞团的级别，随着滋养细胞层评分增高，临床妊娠率和活产率显著增高，而流产率显著降低；尤其对于优质囊胚而言，滋养层细胞对囊胚种植更重要。Bakkensen 等[7]报道滋养细胞层的质量与临床妊娠率和活产率相关。但亦有研究发现，内细胞团评分越高，其囊胚的整倍体率也越高[11]。在新鲜移植周期内细胞团评分与活产率呈正相关关系[6]。

表4 优质囊胚组和非优质囊胚组的妊娠结局比较[n/n（%）]

3.3 优质囊胚与非优质囊胚移植的妊娠结局比较

本研究将复苏周期中单个四期囊胚移植分为两组：优质囊胚和非优质囊胚，发现囊胚的总体质量可预测患者的妊娠结局。优质的四期囊胚有更高的临床妊娠率、更低的生化妊娠率和早期流产率。现有的文献报道均支持相同的观点，即囊胚整体质量显著影响临床妊娠率和活产率[12-14]。内细胞团和滋养层细胞达到A 或B 级的囊胚和其中之一为C 级的囊胚移植后相比，临床妊娠率和活产率有显著性提高[15-16]。

3.4 本研究的局限性

本研究仍存在一定的缺陷。首先，所纳入的复苏周期的单囊胚移植周期数量较少，仍需要继续扩大样本量进行深入分析；此外，后续研究需要细分囊胚的发育天数对妊娠结局的影响。

综上所述，囊胚形态学评分是复苏周期中具有显著意义的评价临床妊娠率的预测指标。对于非优质囊胚而言，滋养细胞层对囊胚种植潜能具有更重要的临床意义，可作为预测临床妊娠率的正性相关指标。本研究为复苏周期中单囊胚移植在形态学评分相似的情况下提供了选择依据。