氟喹诺酮类致药物性肝损伤患者的免疫学及相关遗传因素研究

（.中国人民解放军总医院药品保障中心，北京

100853；2 .重庆医科大学药学院，重庆 400016）

氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones，FQNs）具有高效、低毒、广谱等优点，临床主要用于抗G+菌、G-菌、非典型致病菌和厌氧菌等治疗呼吸道感染以及皮肤和软组织感染，相关药物性肝损伤也逐渐受到关注[1]。国内外已有多个机构发出警示，提示关注FQNs潜在的致肝损伤风险[2-3]。药物性肝损伤（druginduced liver injury，DILI）是指人体暴露于常规剂量或高剂量药物后，因药物本身或其代谢产物对肝脏的直接毒性，或人体对药物或其代谢产物产生过敏或代谢特异质反应而导致的肝脏损伤，是肝生化异常与急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）的常见原因之一[4-6]。虽然DILI的发生机制尚未完全研究清楚，但免疫和遗传因素在其发生和发展过程中一直被认为发挥着重要的作用[7-8]。本研究开展了实时主动监测，采集FQNs用药后发生DILI期间的患者及对照组血样，研究免疫因素在FQNs致肝损伤中的作用机制，并筛选易感基因，以期通过基因筛查预防严重DILI发生。

1 资料与方法

1.1 样本来源及处理

设置药品不良事件主动监测与智能评估警示系统（ADE-ASAS）为实时监测状态，监测目标为2018年1月至2019年10月期间于我院住院且使用FQNs的所有患者。ADE-ASAS依照肝损伤监测模块中提前设置的纳入和排除标准[9]，发出FQNs相关肝损伤患者报警信号，再由两名临床药师进行甄别，结合与临床医师的沟通结果作出最终阳性病例诊断，并纳入病例组。同时，在使用了FQNs且未报警的人群中按照住院时间和病区匹配对照患者。在取得患者知情同意后分别用肝素钠和EDTA-K2真空抗凝采血管取外周血全血5 mL用于后续检测。本研究已获得中国人民解放军总医院伦理委员会审批并坚持遵循赫尔辛基宣言。

1.2 实验室检测

肝素钠管中取全血1 ～ 2 mL及时进行流式细胞术实验，剩余全血经离心后取血浆冻存于- 80 ℃冰箱，用于细胞因子检测。EDTA-K2管中全血分装冻存于- 80 ℃冰箱，用于HLA基因分型。

1.2.1 免疫细胞 应用8色流式方案检测人外周血中的免疫细胞频数分布，包括CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Th22和Treg细胞的含量。

1.2.2 细胞因子 使用Raybiotech抗体芯片试剂盒，利用多重夹心ELISA法的原理检测人外周血中多种细胞因子表达水平，包括GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α。

1.2.3 HLA基因多态性 应用Sanger法对患者的HLA基因进行高分辨率基因分型检测，包括HLAⅠ类基因HLA-A、HLA-B、HLA-C，和HLAⅡ类基因HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1。

1.3 统计学方法

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0进行数据整理和统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布采用中位数（四分位数间距）表示，服从正态分布且方差齐的两组均数比较采用t检验，两组比较的非参数统计采用Wilcoxon秩和检验。计数资料描述采用频数（百分比）表示，两样本率的比较采用χ2检验或Fisher's精确概率法。应用GraphPad Prism 6.0软件作图。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实时监测期间，ADE-ASAS共监测到12 623例使用FQNs的住院患者，报警858例次。其中34例患者确定发生药物性肝损伤。排除高龄（80岁以上）、病情严重、出院或拒绝抽血的患者，最终得到知情同意的DILI患者共10例，按照住院时间和病区匹配了20例使用FQNs后肝功能正常的对照患者。

2.1 免疫细胞

图1 免疫细胞在药物性肝损伤病例组和对照组外周血中的频数分布Fig 1 The frequencies distribution of immune cells in peripheral blood of patients between DILI cases group and control group

流式细胞术结果显示（见图1），在DILI病例组患者的外周血样中，CD4+T细胞和Th22细胞频数较对照组显著升高。

2.2 细胞因子

为比较各免疫细胞的效应分子在DILI患者和对照患者中的表达水平差异，运用ELISA法对多种细胞因子进行检测。检测结果如图2所示，未发现病例组和对照组之间细胞因子表达水平差异具有统计学意义。

2.3 HLA基因多态性

HLA Ⅰ类等位基因和HLA Ⅱ类等位基因在病例组和对照组患者中的分布见表1和表2。研究结果显示，病例组中DRB1*1501和DQB1*0602具有关联性，但未发现不同HLA等位基因的分布差异具有显著统计学意义。

3 讨论

图2 多种细胞因子在药物性肝损伤病例组和对照组中的表达Fig 2 The expression of several kinds of cytokines in DILI cases group and control group

由于DILI的特殊性难以建立合适的动物模型，目前对其发病机制仍未有全面的认识。一般认为，DILI涉及多种机制和细胞通路，除了不同个体之间对药物的代谢作用不同，免疫因素也被认为是导致DILI发生的重要组成部分。已有研究表示，宿主免疫参与了DILI的发病过程，并且患者发生肝损伤的易感性与HLA遗传多态性相关[10]。本研究发现在DILI患者的外周血中CD4+T细胞和Th22细胞频数较对照组显著升高，提示是CD4+T细胞而非CD8+T细胞参与了FQNs引起的肝损伤，而其中的Th22细胞在FQN致肝损伤炎症及免疫病理损伤中可能发挥着重要作用。赖荣陶[11]也曾发现在DILI发生之初，Th22细胞与ALT水平明显正相关，并且肝内IL-22与肝损伤严重程度密切相关，提示通过检测Th22细胞频数及IL-22的表达来判断FQN致肝损伤患者预后的潜在可能性。

在细胞因子检测结果中未发现病例组和对照组之间细胞因子表达水平差异具有统计学意义，但结果显示Th22细胞表达的效应分子IL-13、IL-22和TNF-α在病例组患者中较对照组患者有所升高，与流式细胞术结果病例组中Th22细胞频数较高具有一致性。在2011年，Zhang等[12]将IL-22注射到乙肝病毒（HBV）转基因小鼠体内，发现促炎基因明显上调。另有一项关于慢性丙型肝炎（HCV）的研究显示，肝脏IL-22 mRNA表达在HCV及自身免疫性肝炎中明显升高，认为肝内IL-22水平与病毒性肝炎的肝脏炎症坏死程度可能相关，并推测IL-22可能发挥促炎及肝损伤作用[13]。但在四氯化碳、刀豆球蛋白、Fas配体诱导的急性肝损伤小鼠中发现IL-22蛋白可能保护肝脏抵抗炎症、坏死及凋亡[14-16]。因此，IL-22在不同肝脏疾病模型中的作用尚存争议，提示对于Th22细胞及其效应分子在FQNs致肝损伤疾病进程中的作用仍值得进一步研究。

表1 HLA Ⅰ类等位基因在病例组和对照组中的分布Tab 1 The frequencies of HLA classⅠalleles in cases group and control group

表2 HLA Ⅱ类等位基因在病例组和对照组中的分布Tab 2 The frequencies of HLA classⅡalleles in cases group and control group

此外，有研究认为药物或其代谢产物可作为半抗原与内源性蛋白结合，并随后形成新抗原，当其与特定的HLA分子结合时，可能引起不适当的免疫反应从而导致肝损伤的发生[17]。已发现有多个人类HLA等位基因与特定药物导致的DILI风险增加存在关联性，例如HLA-DRB1*15:01-DQB1*06:02与阿莫西林克拉维酸和罗美昔布致肝损伤相关，HLADRB1*07:01携带者使用希美加群发生肝损伤风险更高[18-22]。在本研究的HLA基因分型结果中未发现分布差异具有显著统计学意义的相关基因。虽然本研究的患者组中DRB1*1501和DQB1*0602具有关联性（即携带DQB1*0602的患者也同时携带DRB1*1501），但单倍型DRB1*1501-DQB1*0602在两组间的分布频率亦未见统计学差异，因此仍需要在更大的样本人群中对该可疑基因进行验证。

本研究基于ADE-ASAS与HIS对接实施实时监测，能够快捷锁定目标人群并及时获取样本，用药者分散在不同病区时尤具优势。最终收集的患者样本量较少，是由于研究过程中因FQNs安全性广受关注，各级监管政策均在收紧，导致初始监测的目标药物莫西沙星使用量显著减少，后期增纳了左氧氟沙星和环丙沙星，报警规则由iSAEC标准调整为国内标准[9]，但效果有限。