芬太尼类药物色谱质谱联用检测方法研究

陈庚超，郭媛媛，鲁志超，杨雪娇

(黄埔海关技术中心，广东 东莞 523000)

芬太尼类药物常见的有芬太尼和去甲芬太尼(芬太尼英文名：Fentanyl，分子式C22H28N2O3，CAS号：437-38-7；去甲芬太尼英文名：N-Phenyl-N-(4-piperidiny)propanamide，分子式C14H20N2O，CAS号：1609-66-1)，为阿片类受体激动剂，属强效麻醉性镇痛药，药理作用与吗啡类似[1]。可适用于各种疼痛及外科、妇科等手术后和手术过程中的镇痛；也可用于防止或减轻手术后出现的谵妄，还可与麻醉药合用，作为麻醉辅助用药[2-3]。近年来，芬太尼类物质的新型合成毒品在美国、加拿大等国迅速发展蔓延，由于该类物质毒性强、品种多、变异快、缉查难，已成为当前国际禁毒领域面临的一大难题[4-5]。2019年 4月1日，公安部、国家卫生健康委员会、国家药品监督管理局联合发布《关于将芬太尼类物质列入非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录的公告》，公安部、国家卫生健康委员会、国家药品监督管理局决定将芬太尼类物质列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》，正式将“芬太尼类物质”按类纳入毒品管制范畴。现阶段还未出台快速、准确，高效的检测标准[6-7]，所以本文旨在使用超高效液相色谱质谱串联三重四级杆质谱仪建立具有高准确性、及时性的检测方法，这对于新型芬太尼类毒品检测管制具有十分重要的意义。

1 实 验

1.1 仪 器

Waters Quattro Preminer XE+UPLC超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪,Waters公司；MS304电子分析天平，梅特勒-托利多仪器公司；Elmasonic P超声波清洗器，德国Elma仪器公司；Allegra X-30多功能台式高速离心机，贝克曼库尔特商贸有限公司；Seven Easy pH计，梅特勒-托利多仪器公司；Milli-Q IQ7000超纯水仪，默克密理博公司。

1.2 试 剂

芬太尼、去甲芬太尼、同位素内标氘代芬太尼标准品，纯度大于98%。甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；乙酸(色谱纯)；醋酸铵(分析纯)；氯化钠(分析纯)；氨水(优级纯)；实验用水除特殊说明外均为一级水。

1.3 标准溶液配制

分别称取芬太尼、去甲芬太尼、D5-芬太尼标准品适量，用甲醇溶解，配制成质量浓度为1000 mg/mL的单标储备液，吸取适量标准储备液用甲醇做溶剂配制成1.00 mg/L的标准溶液，再用甲醇做溶剂将标准溶液稀释成浓度为1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00 ng/mL的系列标准工作溶液。

1.4 样品前处理

1.4.1 血液、尿液等组织液样品

准确称取该类样品10.00 g(液体样品也可准确移取10 mL)于50 mL离心管中，加入适量内标标准溶液，加入20 mL乙腈、约3.5 g氯化钠，充分摇匀后涡旋震荡提取30 min(300 r/min)，8000 r/min充分离心5 min后准备进行固相萃取[8]。

取4 mL上述离心上清液过HLB小柱(HLB柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL超纯水活化)，待样液流干后，依次用3 mL水淋洗，弃去淋洗液抽干，然后用6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，最后用1.00 mL甲醇定容，过0.22 μm有机系滤膜后待上机测试[9]。

1.4.2 芬太尼类原药样品

准确称取0.100 g原药样品于100 mL容量品中，用约80 mL甲醇溶解后，30 ℃超声10 min，降温至室温后用甲醇定容。然后在按比例稀释10000后，加入适量内标，过0.22 μm有机系滤膜后待上机测试。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件的优化

在仪器方法开发过程中，我们分别使用了0.2 mmol/L的醋酸铵水溶液、0.1%的甲酸水溶液、甲醇、乙腈等作为流动相进行不同梯度洗脱程序的测试[10]，进过比较各目标化合物峰形和峰面积相应，最终确定了以0.1%的甲酸水溶液+甲醇作为流动相的洗脱程序作为色谱条件，

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEHC18(2.1×100 mm，1.7 μm)，进样量10 μL，柱温35 ℃，流动相为0.1%甲酸的超纯水溶液+甲醇，梯度洗脱程序见表1，流速0.3 mL/min[11]。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.5.2 质谱条件的优化

将标准工作液注入质谱仪器，经多次优化各个部分条件，达到最佳灵敏度，各条件设置如下述：

(1)毛细管电压：1.20 kV；

(2)锥孔电压：30 V；

(3)离子源温度：110 ℃；

(4)锥孔反吹气流量：60 L/hr；

(5)脱溶剂气气体温度：650 ℃；

(6)脱溶剂气气体流量：300 L/hr；

(7)碰撞气气体流量：0.10 mL/min。

雾化器、辅助加热气、碰撞气等均为高纯液氮或等效氮气发生器，仪器使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求[12]。

质谱参数：正离子电喷雾ESI，多反应监测MRM模式，离子对信息见表2[13]。

表2 芬太尼类化合物质谱参数信息Table 2 Mass spectrum parameters of fentanyl compounds

标准工作溶液经上机测试，在充分优化色谱质谱条件后得到了理想色谱图，如图1中所示。

图1 5.00 ng/mL的芬太尼标准品的总离子流色谱图和MRM模式离子对图Fig.1 Total ion flow chromatogram and MRM mode ion pair diagram of 5.00 ng/mL fentanyl standard

2 结果与讨论

2.1 结果计算和表述

本方法按标准曲线内标法定量，按式(1)计算样品中芬太尼、去甲芬太尼残留量。计算结果需扣除空白值。

(1)

式中：W——样品中目标化合物残留量，μg/kg

C——芬太尼、去甲芬太尼在标准曲线内标法中计算出的目标化合物浓度，ng/mL

V1——乙腈提取液总体积，mL

V2——分取提取液体积，也即为过柱子样品上清液总体积，mL

V3——最后样品定容体积，mL

M——取样总质量，g

在重复性条件下测得的两次平行独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%，结果保留三位有效数字。

2.2 线性范围及检出限

实验室配置标准溶液浓度为1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00 ng/mL的系列标准工作溶液，按本方法经仪器上机测试后，以化合物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归方程，芬太尼、去甲芬太尼线性相关系数均在R2=0.99以上，符合实验检测的要求，所以本文所述的线性范围5.00～100 ng/mL。采用1.00 ng/mL标准溶液色谱图，以3倍信噪比(S/N)来计算检出限[14]，确定本方法芬太尼、去甲芬太尼的检出限均为0.50 ng/mL，定量限均为1.00 ng/mL。

2.3 精密度及回收率

称取不含待测组分的某尿液样品10.00 g共20份，其中2份按照实验方法进行处理作为对照组[15]，另外18份样品分成3组，分别按三水平六平行的原则添加混合标准溶液，制成10、20和100 μg/kg 的3组不同浓度的样品进行添加回收试验，实验结果平均回收率为85%～110%之间，RSD为RSD≤5(n=6)，回收率和精密度见表3[16]。

表3 回收率和精密度(n=6)Table 3 Recovery and precision (n=6)

3 结 论

本文采用同位素内标稀释结合SPE固相萃取技术，超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪的检测方法对常见芬太尼类药物进行检测分析，该方法不仅前处理简单、提取效率高、操作方便等优点外，还具有准确度高、低检出限，高灵敏度及精密度等特点，能够符合实验室对常见芬太尼类药物的确证工作要求。