液态与固态酵素理化成分及抗氧化活性的研究

余思洁，OH YOUNG JOO ，李洪军，KIM TAE SUK ，贺稚非*，LEE SANG YUN ，李少博，李敏涵

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(韩国圃美多有限责任公司，韩国，120-749)

酵素是由日语中的“酶”翻译而来的，是日本对酶的别称[1]，狭义上的酵素是指酶，现在市面上的酵素是广义上的酵素，是包含酶和其他生物活性物质的混合物。我国《酵素产品分类导则》将食用酵素定义为：以动物、植物、菌类为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可食用的酵素产品[2]。植物酵素是其中常见的一类，通常采用一种或多种果蔬、谷物以及中草药等植物作为原料，经有益菌发酵后，形成富含酚类、黄酮类、花青素[3-4]等生物活性物质以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、蛋白酶等功能酶的可食用发酵型液态或固态食品。具有抗氧化[5]、调节免疫[6]、润肠通便[7]等功能，备受消费者青睐。

目前市面上销售的酵素产品主要可以分为液态酵素和固态酵素。液态酵素是经过发酵、灭菌、包装等必要的处理后在常温下是液态的酵素产品，固态酵素是将发酵后得到的液态酵素进行喷雾干燥或真空冷冻干燥等技术制得的形态为粉末、颗粒、片状或块状的酵素产品[2,8]。固态酵素的出现丰富了产品形态，且具有便于运输、贮藏、使用等特点[9]，但是在干燥过程中可能会对酵素中的理化成分或生物活性物质造成破坏，从而影响到酵素的功能酶活力和抗氧化活性等。

国内在制备食用酵素方面的研究迅速发展，逐渐开发出各种新型酵素产品，但市场上的产品质量参差不齐，科学研究主要集中在开发不同原料酵素的制作工艺方面[10]，对市售液态酵素和固态酵素2种不同形态产品的质量及功能性的对比研究鲜有报道。为了分析与比较市售不同形态酵素产品的差异，选取市面上常见的3种液态酵素和3种固态酵素，测定其理化成分、生物活性物质以及抗氧化活性，并分析差异，为酵素产品的开发和市场推广提供理论依据，促进酵素行业的多元化发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验选取6种市售酵素产品(3种液态酵素，3种固态酵素)，均购置于各品牌酵素专卖店，为正规的工业化生产酵素产品，详细信息见表1。

表1 市售酵素样品信息

NaOH、HCl、CuSO4、乙醚、石油醚、乙醇、乙酸钠、橄榄油，重庆市钛新化工有限公司；乙酸锌、铁氰化钾、Al(NO3)3、Na2CO3、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖标准品、没食子酸标准品，重庆跃翔化工有限公司；酚酞、NaNO2、冰乙酸，上海易恩化学技术有限公司；亚铁氰化钾、聚乙烯醇、福林酚,上海源叶生物科技有限公司；KCl、酪蛋白，北京酷来搏科技有限公司；酒石酸钾钠、FeCl3、三氯乙酸，成都西亚化工股份有限公司；SOD活性检测试剂盒、芦丁标准品，北京索莱宝科技有限公司；L-酪氨酸，成都瑞芬思生物科技有限公司；DPPH，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

HH-4型数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；BSA323S型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计，日本岛津公司；5430R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；PAL-1手持式折光仪，广东市爱宕科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

消费者在摄入液态酵素时是直接饮用，而摄入固态酵素产品时需要加入水将固态酵素变为液态，为保证2类产品的可比性，试验前先对固态酵素进行预处理，根据产品说明中的食用方法，分别取样品5 g，纯水定容至100 mL，作为试验样品备用。

1.3.2 液态酵素与固态酵素感官评价

参考食用植物酵素[11]感官要求及邢慧雅[12]的方法，结合酵素产品的感官特点，对酵素进行感官评价，取处理后的酵素样品各100 mL，由10位接受过感官评价培训的专业人员(5男5女)根据感官评价标准进行评分，感官评价标准见表2。

表2 酵素产品感官评分标准

1.3.3 液态酵素与固态酵素理化成分的测定

pH值测定：参考GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》使用pH计进行测定。

总酸含量(以苹果酸计)测定：按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》进行测定。

还原糖含量(以葡萄糖计)测定：按照GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》中的直接滴定法进行测定。

可溶性固形物测定：手持式折光仪。

1.3.4 总酚含量的测定

参考ADOM等[13]的方法，采用福林酚法测定，以没食子酸为标准品绘制标准曲线y=0.021 3x+0.036 8(R2=0.994 9)。

1.3.5 总黄酮含量的测定

参考LIU等[14]的方法，采用Al(NO3)3显色法测定，以芦丁为标准品绘制标准曲线y=0.013x-0.034(R2=0.996 6)。

1.3.6 花青素含量的测定

参考LEE等[15]的方法，采用pH示差法测定。

1.3.7 功能酶活力的测定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)酶活力的测定：采用SOD活性检测试剂盒测定。

脂肪酶活力的测定：参考GB/T 23535—2009,使用滴定法进行测定。

蛋白酶活力的测定：参考GB/T 23527—2009,使用福林法进行测定，以L-酪氨酸为标准品绘制标准曲线y=0.01x+0.003 4(R2=0.999 9)。

α-淀粉酶活力的测定：参考GB/T 24401—2009进行测定。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的测定

参考ALVAREZ等[16]的方法，将试验样品进行稀释，配制成1、2.5、5、10、20、50、100、200、400、600、800、1 000 μL/mL的待测液，在1 mL待测液中加入0.2 mmol/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)乙醇溶液3 mL，混匀避光30 min，测定517 nm处吸光度，按公式(1)计算DPPH自由基清除率：

(1)

式中：Ai, 样品+乙醇的吸光度；Aj, 纯水+DPPH乙醇溶液的吸光度；A0，样品+ DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.3.9 总还原力的测定

参考SUN等[17]的方法略作修改。将试验样品进行稀释，配制成5、10、20、50、100、200、500、1 000 μL/mL的待测液，在1 mL待测液中加入pH 6.6的磷酸缓冲液2.5 mL及10 g/L的铁氰化钾溶液5 mL，混匀后在50 ℃水浴20 min，再加入100 g/L的三氯乙酸溶液5 mL混匀，离心后取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸馏水及1 g/L的FeCl3溶液0.5 mL，混匀，在700 nm处测定吸光度。

1.4 数据处理与分析

试验平行进行3次，采用Origin 8.1软件绘制图表，采用SPSS 21.0、 Excel 2007等软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同酵素产品感官评价

感官评定结果如图1所示。Y1和G2在5个方面的评分均较高，得分均在8～9分之间，产品无沉淀，颜色鲜亮，酸甜适口，香味醇正，总体的风味和谐。Y3、G1、G3的香味和风味得分比较高，均在7分以上，但由于有少量的沉淀或悬浮物，导致口感不够顺滑，色泽不够鲜亮，影响了感官评分。Y2在组织状态、色泽、口感3个方面的得分比较高，但由于滋味不协调，有涩味影响了感官评分。总体来说，酵素产品的原始状态对不同酵素产品的感官评价评分影响不大，主要取决于具体产品。

图1 液态酵素与固态酵素感官评价雷达图

2.2 不同酵素产品理化成分测定结果

由表3可知，6种酵素产品的pH都较低，可能是发酵过程中有机酸浓度增加所致[18]，液态酵素的总酸含量均高于固态酵素，这可能是由于固态酵素在干燥过程中成分损失造成的。在发酵过程中，糖类物质作为碳源和能源物质，会被微生物分解，导致还原糖和可溶性固形物含量较低[19]， Y1、Y2的还原糖含量、可溶性固形物含量较高且显著高于其他酵素，可能是原料不同或在生产过程中为防止产品酸味过重，酸甜度不协调，添加了糖类物质调节产品滋味造成的[20]。

表3 不同酵素产品的理化指标

2.3 不同酵素产品活性成分测定结果

2.3.1 总酚含量

从图2可知，不同酵素产品的总酚含量有显著差异(P<0.05)，液态酵素的总酚含量均显著高于固态酵素，其中Y2的总酚含量最高，为1 656.22 μg/mL，G1的含量最低，为7.78 μg/mL，在固态酵素中，G3的总酚含量最高，为175.76 μg/mL，Y2的总酚含量是G3总酚含量的9.4倍，说明固态酵素在干燥过程中可能导致酚类物质破坏，与冯彦君[21]的研究结果一致。原料种类对同一状态的酵素产品总酚含量有较大影响，但原料种类的多少与总酚含量的高低关系不大，猜测可能与原料本身总酚含量[22]或发酵菌种的选取[23]有关，固态酵素总酚含量差异可能还与干燥工艺的选取有关[24]。

图2 不同酵素产品的总酚含量

2.3.2 总黄酮含量

由图3可知，不同配方的酵素产品的总黄酮含量有显著差异(P<0.05)，含量高低依次为：Y1>Y3>Y2>G2>G1>G3，液态酵素总黄酮含量高于固态酵素，其中Y1的总黄酮含量最高，为124.56 μg/mL，G3的含量最低，为1.91 μg/mL，G2是固态酵素中总黄酮含量最高的，为21.48 μg/mL，Y1的总黄酮含量是G2的5.8倍，目前在植物类粉末产品生产上常用的干燥方式有喷雾干燥、热风干燥及真空冷冻干燥等[25]，而黄酮类物质对温度比较敏感，可能是在干燥过程中受温度的影响，发生酚类氧化反应，造成了总黄酮含量下降[26]。

图3 不同酵素产品的总黄酮含量

2.3.3 花青素含量

从图4可知，不同配方酵素产品的花青素含量有显著差异(P<0.05)，液态酵素的花青素含量显著高于固态酵素，Y3的花青素含量最高，为22.49 mg/L，G2的花青素含量最低，为0.22 mg/L，G1是固态酵素中花青素含量最高的，为2.38 mg/L，Y3的花青素含量是G1的9.5倍。固态酵素中的花青素含量显著低于液态酵素，可能是由于花青素具有热不稳定性，在干燥过程中极易被破坏[27]。

图4 不同酵素产品的花青素含量

2.3.4 功能酶活力

6种市售酵素的功能酶活力测定结果见表4，可以看出不同酵素产品的同一种功能酶活力不同，6种酵素的SOD酶活力均较高，但差异很大，在193.23～1 214.46 U/mL之间，固态酵素的SOD酶活力显著低于液态酵素，说明可能与各种酵素的后处理方式有关。与SOD酶活力相比，市售酵素的蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶活力较低，可能是由于大部分果蔬的脂肪和蛋白质含量低使得微生物在代谢过程中产生的蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶的量少，液态酵素的蛋白酶、脂肪酶活力显著高于固态酵素，可能是固态酵素的干燥过程造成了损失[28]。3种液态酵素几乎无α-淀粉酶活力，固态酵素α-淀粉酶活力较低，这可能是与发酵原料、菌种以及环境条件有关。

表4 不同酵素产品的功能酶活力分析

2.4 不同酵素产品对DPPH自由基清除能力的测定结果

如图5所示，6种酵素产品中的DPPH自由基清除能力由大到小依次为：Y2>Y1>Y3>G2>G3>G1，液态酵素的DPPH自由基清除能力显著高于固态酵素，经计算，Y2具有最高的DPPH自由基清除能力，其IC50为5.65 μL/mL，而最低的固态酵素G1在最大浓度时的DPPH自由基清除率仅有47.46%，无法计算其IC50值，除G1外的其余5种市售酵素的IC50值均在5.65～52.23 μL/mL。CHU等[29]研究表明，发酵物质对自由基清除率表现出差异可能是原料、微生物菌种和发酵液代谢产物等的不同造成的。

a-样品体积分数0～1 000 μL/mL;b-样品体积分数0～200 μL/mL

2.5 不同酵素产品总还原力的测定结果

还原力的大小通常与还原剂的多少有关，还原剂能够破坏自由基链，给出氢原子，发挥抗氧化作用，因此，还原力可以作为评价酵素的抗氧化活性的重要指标,测定结果如图6所示。

图6 不同酵素产品的总还原力

2.6 不同酵素产品主要成分及抗氧化能力的相关性分析

由表5可知，DPPH自由基清除能力与脂肪酶活力呈极显著正相关(P<0.01)，与还原糖、总酚、SOD酶、蛋白酶活力均呈显著正相关(P<0.05)，说明不同配方的酵素产品中的总还原力由大到小依次为：Y2>Y1>Y3>G2>G3>G1，液态酵素的总还原力显著高于固态酵素。

表5 相关性分析结果

DPPH自由基清除主要受还原糖、总酚、SOD酶、蛋白酶、脂肪酶活力的影响。总还原力与可溶性固形物、总酚、SOD酶、蛋白酶、脂肪酶活力均呈极显著正相关(P<0.01)，与还原糖呈显著正相关(P<0.05)，说明总还原力主要受可溶性固形物、总酚、SOD酶、蛋白酶、脂肪酶活力的影响，这些物质的作用取决于其具体结构和性质[30]。

3 结论

对液态酵素和固态酵素进行了对比分析，酵素产品整体都含有较高的活性物质和具有较强的抗氧化活性，但是不同酵素产品的活性物质含量有显著性差异，这可能与原料、菌种以及环境条件有密切关系。液态酵素的抗氧化能力相对较强，同时根据相关性分析结果，主要是由于液态酵素中还原糖、总酚、SOD酶、蛋白酶含量相对较高。液态酵素质量优于固态酵素，可能是固态酵素的干燥工艺导致功能活性物质被破坏，从而影响固态酵素产品的品质。不同产品间的各类物质含量及抗氧化能力差异较大，总体趋势是液态酵素主要成分含量较高，功能酶活性较强，抗氧化能力较强。为促使人们正确看待酵素产品，了解产品品质提供了参考，对于促进酵素行业健康发展具有指导意义。