高盐稀态酱醪中耐盐生香酵母的筛选及生香特性研究

彭东，蒋雪薇,2*，陈幽，陈进，张伟，周慧,2，吴灿，方勤军

1(长沙理工大学 化学与食品工程学院，湖南 长沙，410114) 2(湖南省调味品发酵工程技术研究中心，湖南 长沙，410600) 3(加加食品集团股份有限公司，湖南 长沙，410600)

酱油是经微生物发酵而成的一种传统调味品，因其独特的风味而广受消费者的喜爱[1]。酱油酿造工艺在我国主要有低盐固态发酵、传统高盐稀态发酵(晒露法)及现代高盐稀态发酵3种方式[2]。近年来，国内大型企业大多采用现代高盐稀态发酵工艺，但该工艺采用的封闭式发酵在减少酱油污染菌的同时，也减少了一些有利于酱油的风味菌，导致酱油风味物质不足。因此，要想在封闭发酵系统及较高盐浓度下获得风味上乘的酿造酱油，加快选育高耐盐的风味菌是最主要的解决途径。

生香酵母是一类以代谢合成酯类物质为主，同时还能促进醇、醛、酚等挥发性风味物质产生的酵母菌[3-4]。国内的生香酵母最早应用于白酒以弥补酒香的不浓郁，随后扩展到酱油[5]、黄酒[6]、面包[7]及果醋[8]等发酵食品中应用。目前应用于酱油增香的酵母菌主要包括鲁氏酵母(S酵母)、球拟酵母(T酵母)以及部分假丝酵母属(C酵母)[5]，而对其他种属酵母菌的研究还相对较少。因此，筛选酱油酿造生香酵母，研究其生香特性及应用成为酱油酿造微生物的重要研究方向之一。本文从高盐稀态酱醪中筛选出生香优良的耐高盐酵母，添加于高盐稀态酱醪中，通过分析它们产生的挥发性风味物质种类及含量来研究生香特性，有利于增加酱油酿造酵母的菌种资源，为高盐稀态酱油酿造工艺提供优质的发酵菌种，同时为解析高盐环境中酵母的生香机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高盐稀态酱醪，取自于湖南某酱油厂；黄豆芽，市售；三丁酸甘油酯(分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司；2-甲基-3-庚酮(内标物，99.5%，色谱纯)，德国Dr.Ehrenstorfer公司；酵母基因组DNA提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；TaqDNA聚合酶，上海生工生物工程有限公司。

1.2 培养基

豆芽汁培养基[9]。

透明圈筛选培养基：酵母膏10 g，三丁酸甘油酯4 mL，NaCl 100 g，琼脂粉2 g，加入1 000 mL蒸馏水，自然pH，121 ℃灭菌20 min。

1.3 仪器与设备

ARZ-200游标卡尺，青岛美吉特精密仪器工具有限公司；UV1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司；ZWY-2102C恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；VERITIPCR扩增仪，美国ABI公司；YRE2000B旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；436 GC/EVOQ TQ/PAL气质联用仪，美国布鲁克科技有限公司；Rxi-5Sil MS色谱柱，美国Restek公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取针，美国Supelco公司。

1.4 实验方法

1.4.1 耐盐酵母的分离纯化

将高盐稀态酱醪样品进行梯度稀释后，吸取0.1 mL(10-4、10-5、10-6样品稀释液)涂布于含100 g/L NaCl的豆芽汁培养基中，每个梯度进行3个重复实验，28 ℃培养2～3 d，挑选疑似酵母菌的单菌落进行镜检，将初步镜检结果为酵母菌的菌株在含100 g/L NaCl的豆芽汁平板上进一步分离纯化获得纯培养菌株。

1.4.2 产酯酵母的筛选

1.4.2.1 透明圈法初筛

将初筛得到的酵母菌采用点种的方式接种于透明圈筛选培养基中，28 ℃培养2～3 d观察产生的变色圈现象，使用游标卡尺精确测量透明圈直径D及菌落直径d，并计算D/d，每个菌进行3个平行实验。

1.4.2.2 产酯能力复筛

将初筛得到的酵母菌取1 mL 108CFU/mL接种于100 mL含100 g/L NaCl的豆芽汁液体培养基中，在28 ℃培养箱中静置培养7 d，再将培养的菌体培养液利用旋转蒸发仪在60 ℃下蒸馏30 min得到菌体培养液馏分，用回流皂化法[10]测其中的总酯含量，每个菌进行3个平行实验，筛选出总酯积累量高的菌株。

1.4.3 耐盐产酯酵母的鉴定

1.4.3.1 耐盐产酯酵母的生理生化特性

将复筛得到的酵母菌进行糖发酵实验、碳/氮源同化实验、产类淀粉实验及产脲酶实验，具体参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[11]。

1.4.3.2 耐盐产酯酵母的26S rDNA序列分析

采用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌模板DNA，进行PCR。PCR扩增：使用酵母菌的通用引物(NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’；NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)；采用50 μL的PCR反应体系：2 μL模板DNA，2 μL NL1，2 μL NL4，5 μL 10×PCR Buffer，3 μL Mg2+(25 mol/L)，1 μL dNTP(10 mol/L)，1 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，ddH2O补齐至50 μL；PCR反应条件基于高洁等[12]的方法并进行了优化。具体为：95 ℃预热1 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环后72 ℃末端延伸7 min，4 ℃保存。PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶检测。

测序由生工生物工程(上海)股份有限公司武汉分公司完成。测序结果在NCBI库进行同源性比对，并通过MEGA X软件构建系统发育树。

1.4.4 菌种性能测试

将鉴定的酵母菌分别接种于含100、160 g/L NaCl的豆芽汁液体培养基中，在28 ℃、180 r/min下培养48 h，在0～48 h内每隔4 h取样测OD570值，绘制生长曲线，并在48 h时取样倒平板计算活菌数。在28 ℃培养箱中静置培养7 d，使用回流皂化法测定总酯含量。

1.4.5 生香特性分析

1.4.5.1 感官分析

将所分离鉴定的酵母菌接种于160 g/L NaCl豆芽汁液体培养基中，于28 ℃、180 r/min条件下培养7 d，感官评定实验嗅闻其香气[13]。

1.4.5.2 高盐稀态酱醪发酵工艺

将500 g成品曲与1 L盐水(230 g/L NaCl)混合，置于28 ℃下恒温发酵。将3种酵母制备成107CFU/mL的菌悬液，采用高盐稀态酱醪发酵，第30天分别加入5 mL 3株酵母的菌悬液，继续发酵30 d，总发酵周期为60 d，对照组为未添加酵母发酵的酱醪。在发酵结束后通过压榨酱醪获得酱油。

1.4.5.3 SPME-GC-MS分析

固相微萃取(solid-phase micro extraction, SPME)：取压榨酱油，添加5 μL质量浓度为0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮甲醇溶液作为内标物[14]，总体积为2 mL，在50 ℃下加热振荡25 min，吸附20 min后进样；GC条件：进样口温度250 ℃，程序升温，40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min，载气为高纯He，流速为1.0 mL/min，分流比为10∶1；MS条件：EI离子源。电子能量70 eV，发射电流200 μA，离子源和传输线温度为250 ℃，质量扫描范围m/z30～500。挥发性化合物定性分析[15]：采用NIST14谱库进行检索比对样品中所含化合物，再与保留时间、标准质谱比对来确定化合物结构。

挥发性化合物半定量按公式(1)计算[16]：

(1)

式中：C1，挥发性化合物浓度；C2，内标物浓度；A1，挥发性化合物峰面积；A2，内标物峰面积。

1.5 数据处理

利用SPSS 22软件进行方差分析，并通过多重字母标记法(Duncan’s)进行显著性差异分析(P<0.05)[17]、Origin 9.0进行数据可视化处理。

2 结果与分析

2.1 耐盐酵母的分离纯化

高盐稀态酱醪中存在一些天然接种的酵母，因长期在高盐环境下生长，具有了较好的耐盐能力，选择高盐稀态酱醪，采样分离耐盐酵母，在豆芽汁平板上挑选典型酵母菌单菌落进行分离纯化，得到3种形态的酵母菌34株，将其命名为CS2.20～CS2.53，其菌落及菌体形态见图1。

图1 三种酵母菌的菌落及菌体形态(40×16)

图1-a中的酵母菌菌落为乳白色、边缘整齐、呈圆形、较厚、不透明，表面较湿润，菌体形态为椭圆形，芽殖，无假菌丝；图1-b中的酵母菌落为乳白色、边缘整齐、呈圆形、较厚、不透明，表面较粗糙，椭圆形菌体，芽殖，无假菌丝；图1-c中的酵母菌落为乳白色、边缘整齐、呈圆形、较厚、不透明，表面较湿润，椭圆形菌体，芽殖，有假菌丝。

2.2 耐盐产酯酵母的筛选

酯类物质在微生物细胞中主要由酯化反应产生，其关键酶为酯化酶，酯化酶活力大小能反映其合成酯类物质能力[18]。酯化酶是一种同工酶，既能催化酸和醇合成酯，也能水解酯形成酸和醇[19]，因此，可以利用酵母菌产生的酯酶水解三丁酸甘油酯形成的透明圈[20]与菌落直径比(D/d)值大小来判断其酯酶活力。在图2-a中，D/d>2.0的酵母菌有5株，为CS2.23、CS2.30、CS2.31、CS2.42及CS2.53，D/d分别为2.1、2.5、2.5、3.0及2.6。总酯是耐盐酵母在生长代谢中产生酯类物质的总量，是判断生香酵母产香能力的重要指标[21]。在图2-b中，总酯含量>1.00 g/L的酵母菌一共有4株，包括CS2.23、CS2.24、CS.2.42及CS2.53，酯含量分别为1.18、1.16、1.51及1.46 g/L。

a-耐盐产酯酵母的D/d值;b-耐盐产酯酵母的总酯含量

透明圈菌落直径比(D/d)值的大小能较好地反映菌株的酯化酶活力，通过透明圈法初筛的5株菌中的3株菌，液体发酵条件下总酯积累量高，因此，在筛选量较大的情况下，透明圈法能比较准确地初筛获得产酯良好的菌株。酯化酶催化的酯化反应是酵母菌中合成酯类物质的重要途径，但这条途径合成速率较慢，故透明圈法初筛的菌株需进一步验证其产酯能力。总酯则能直观反映酵母菌利用所有途径获得的产酯量，但培养体系中的营养物质对产酯有较大的影响。酱油发酵体系中的营养物质较豆芽汁培养基丰富，且发酵时间相对长，故选择酯化酶活力和总酯测量值均较高的酵母菌CS2.23、CS2.42、CS2.53进行生香特性研究。

2.3 耐盐产酯酵母的鉴定

如图3-a所示，3株菌的扩增条带分离明显无拖尾，长度在600 bp左右。将筛选得到的3株菌的PCR产物进行26S rDNA序列分析，构建系统发育树，见图3-b。

a-26S rDNA 凝胶电泳图;b-系统发育树

为了更加准确地判断3株酵母菌的种属，对3株菌的生理生化特性进行研究，结果如表1所示。从表1可以看出，CS2.23、CS2.53只能利用葡萄糖，CS2.42能利用葡萄糖、麦芽糖；CS2.23不能同化山梨糖、海藻糖、乳糖及可溶性淀粉，CS2.42不能同化乳糖、可溶性淀粉及柠檬酸，CS2.53不能同化乳糖；CS2.23、CS2.53均能利用KNO3和NH4NO3两种氮源，CS2.42只能利用KNO3；3株菌均不能产生类淀粉及脲酶。参考《酵母菌的特征及鉴定手册》分析生理生化特性，根据NCBI比对的结果最终判断CS2.23为粉状毕赤酵母(Millerozymafarinosa)、CS2.42为鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、CS2.53为近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)。

表1 三株酵母菌的生理生化特性

2.4 耐盐产酯酵母的菌种性能研究

耐盐产酯酵母在高盐下能正常生长是其能在高盐稀态酱醪发酵中应用的基本前提。高盐稀态酱醪发酵中，NaCl质量浓度一般在160 g/L左右，随着人们对健康越来越重视，100～120 g/L NaCl的减盐发酵成为当前的关注热点。对3株菌在高盐(160 g/L NaCl)和低盐(100 g/L NaCl)环境下的菌种性能进行考察，结果见图4。在图4-a中随着NaCl浓度的提高，3株菌的生长能力有所下降，菌株CS2.23的OD570下降6.4%，CS2.42下降9.05%，CS2.53下降14.47%，但仍然保持较好的生长特性；不同盐浓度下3株菌的生长趋势比较接近，对数生长期的起始时间由低盐培养的4 h推迟到高盐培养的12 h，酱油的高盐稀态发酵周期一般为6个月，3株菌进入对数期延缓的8 h对于长周期的酱油发酵不会产生影响。在图4-b中随着NaCl浓度提高，3株菌的活菌数有所下降，在高盐环境下3株菌的活菌数均维持在106CFU/mL左右，说明其在高盐环境均具有较好的繁殖能力，能获得≥106CFU/mL的活菌进行酱醪发酵。在图4-c中随着NaCl浓度提高，3株菌的总酯好了呈下降趋势，总酯含量与活菌数量呈正相关，说明菌株的生长能力影响了菌株的代谢产酯能力；在高盐环境下3株菌的总酯含量下降了0.5 g/L左右，但均在0.7 g/L以上，仍具有较好的产酯能力，适合进一步应用于高盐稀态酱醪发酵。

a-不同NaCl质量浓度下的酵母菌生长曲线;b-不同NaCl质量浓度下的活菌数;c-不同NaCl质量浓度下的总酯含量

2.5 耐盐产酯酵母生香特性研究

菌种产酯能力强并不能说明其在发酵过程中能增香，因此，在进行高盐稀态酱醪发酵前，有必要对菌种发酵液的香气进行初步的嗅闻分析。为缩短发酵时间，采用160 g/L NaCl豆芽汁液体培养基摇瓶培养所筛选的3株菌，经嗅闻测试发现3株菌均无不良气味，且CS.23具有水果香、麦芽香，CS2.42具有浓郁的水果香、玫瑰花香，CS2.53具有水果香，适合进一步用于酱油酿造分析。为了进一步探明3株菌的香气成分及浓度，将这3株菌添加至高盐稀态酱醪发酵，共检测出46种挥发性风味物质(表2)。添加CS2.23、CS2.42及CS2.53发酵的酱油中挥发性风味物质总含量较对照组分别提高了81.30%、140.00%及87.87%，均有较大提升，说明3株酵母可作为酱油酿造生香酵母使用。但3株菌产生的挥发性风味物质含量还存在较大的差异，故而出现了香气嗅闻结果不同的现象。

表2 三株酵母菌发酵酱油的挥发性风味物质分析

续表2

酯类物质是酱油中关键的一类挥发性风味物质，主要由生香酵母产生的酶催化前体物质合成[29]。从表2可知，添加3株菌的发酵酱油中一共定量检出17种酯类物质，在添加菌株CS2.23、CS2.42及CS2.53的发酵酱油中数量分别为12、15及16种，较对照组分别增加了3、6及7种，而相应的含量也比对照组提高了188.60%、296.13%及226.87%。挥发性酯类物质总含量排序为CS2.42>CS2.53>CS2.23，这与总酯测量值排序结果一致，说明3株菌所积累的挥发性酯类物质含量与总酯含量呈正相关的关系。因此，添加生香酵母发酵可以通过增加酯类物质的数量及含量提升酱油香气成分的丰富度。在添加3株菌发酵酱油检出的酯类物质中，最多的是乙酯类(13种)，这可能是由于3株菌具备较好产乙醇能力，在发酵后期，乙醇进一步与有机酸经酯酶催化合成乙酯所致。所检出的乙酯类物质主要是具有水果香的乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯，具有甜奶油香的乳酸乙酯，花果香的月桂酸乙酯及蜡香的棕榈酸乙酯等，它们给酱油提供了前香、主体香及尾香的物质构成。乙酯类物质中含量增加最明显的是乙酸乙酯，在添加生香酵母CS2.23、CS2.42及CS2.53的发酵酱油中含量分别比对照组提高了387.60%、533.84%及465.01%，这为其发酵酱油前香及主体香的构成奠定了重要的物质基础，乙酸乙酯也成为添加3株菌在酯类物质风味特征上的重要成分。除此以外，3株菌发酵酱油中还检测到2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯及14-甲基十五烷酸甲酯，这些物质在对照组中未检出，为3株菌形成特色的酯类香气提供了基础。

醇、醛、酚是除酯类物质之外比较重要的几类挥发性风味物质。醇类物质主要由酵母菌经糖酵解或Enrlich途径产生[30]，是酱油中醇香风味的来源、同时为酯类物质的形成提供物质基础。添加菌株CS2.23、CS2.42及CS2.53的发酵酱油中分别定量检出醇类物质7、8及7种，与对照组(7种)在数量上无明显差异，但含量有较大的提升，分别较对照组提升了91.55%、163.04%及87.19%。添加3株菌的发酵酱油中，乙醇均比对照组有明显提升，乙醇是酱油醇香的主要来源，也是形成乙酯的重要物质，其构成了酱油的基础香气。添加CS2.23的发酵酱油中3-甲基-1-丁醇及2,3-丁二醇含量是3株菌中最高的，且较对照组提升明显；3-甲基-1-丁醇具有麦芽香，能赋予酱油香气的浓郁感；2,3-丁二醇具有水果香，能氧化生成乙偶姻，进一步生成吡嗪类物质，形成酱油的焦香。添加CS2.42的发酵酱油中除乙醇外，1-辛烯-3-醇及苯乙醇含量是3株菌中最高的，且较对照组提升明显；1-辛烯-3-醇具有蘑菇香，除增加酱油香气的浓郁感外还赋予酱油鲜香醇厚感；苯乙醇具有玫瑰花香，是中国酱油典型的香气成分。添加CS2.53的发酵酱油中除乙醇外，比较典型的香气物质是1-辛烯-3-醇，其含量较对照组也有比较明显地提升。醛类物质主要来源于氨基酸的降解和微生物的发酵转化，具有调和香气的作用[31]。表2显示，一共检测出5种醛类物质，添加3株菌的发酵酱油中醛类物质含量较对照组有一定的提升，其中添加CS2.42的发酵酱油中具有水果香的苯乙醛含量在3株菌种最高，较对照组提升了44.21%；另外，添加CS2.53的发酵酱油中检出了少量具有玫瑰香的壬醛。酚类物质一共检测出4种，添加CS2.53的发酵酱油中酚类物质数量及含量均为3株菌中最高，其特征香气物质为4-乙基愈创木酚及4-乙烯基愈创木酚，其中4-乙基愈创木酚在其他组中未检出，4-乙烯基愈创木酚含量较对照组提升了136.56%。酮类、酸类、含硫化合物和其他类物质在3株菌及对照组发酵酱油中的种类和含量变化不大，表明筛选得到的3株菌对这几类挥发性物质的影响较小。

从3株菌液体发酵后的嗅闻试验结果结合SPME-GC-MS分析可知，CS2.23发酵具有水果香及麦芽香，是由于CS2.23在发酵中产生了水果香的乙酸乙酯及麦芽香的3-甲基-1-丁醇为主的特征香气物质；CS2.42发酵具有浓郁的水果香、玫瑰花香则是由于其发酵产生了乙酸乙酯、苯乙醇、1-辛烯-3-醇及苯乙醛为主的特征香气物质，其中乙酸乙酯及苯乙醛贡献了水果香，苯乙醇贡献了玫瑰花香，而1-辛烯-3-醇则形成了浓郁感；CS2.53发酵的特征香气物质为乙酸乙酯、4-乙基愈创木酚及4-乙烯基愈创木酚，形成的风味也是水果香为主风味。3株菌的主要特征香气物质均有乙酸乙酯，因其风味阈值较低(5.00 μg/L)，故其发酵的嗅闻特征表现出水果香为基础香气，其他特征香气物质的存在形成了3株菌在香气总体特征上的差异，而挥发性风味物质数量及含量较对照组的明显增加则构成了酱油香气的丰富度及醇厚感。

3 结论

本研究从高盐稀态酱醪中筛选获得3株生香优良的酵母菌CS2.23(M.farinosa)、CS2.42(Z.rouxii)、CS2.53(C.parapsilosis)。研究菌种性能发现，3株菌在160 g/L NaCl质量浓度下生长良好，具有较好的繁殖能力及产总酯能力；3株菌具有不同的生香物质基础，进而形成了不同的香气特性，酯类挥发性风味物质的含量较对照组有明显的提高，且醇类、醛类及酚类等其他类挥发性风味物质也有一定的提升。研究显示，分离自高盐稀态酱醪的3株耐盐生香酵母有不同的产酯生香特性，具备酱油酿造生香酵母的开发潜力。