吉法酯保护干眼症大鼠的机制研究*

糜玲，周波，李永1,，彭金刚1,，汤磊，黄家宇*

(1.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550004；2.贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004)

干眼症是眼科常见疾病，由多种因素诱发，症状因人而异，常见症状有异物感、干涩感、眼痒、分泌物黏稠、畏光以及视力波动等[1]。近年来，随着对干眼症的研究不断深入，发现几乎所有的干眼症病理机制都有炎症因子的参与[2-3]，同时细胞凋亡也起着关键性的作用[4-8]。泪腺细胞凋亡的增加可以减少泪液的分泌，同时引起眼部相关组织的损伤[9]；泪腺细胞长期的凋亡和损伤会造成眼部相关组织炎症保持持续的激活状态，炎症和凋亡相互影响，从而使干眼症患者更容易产生眼干、眼涩等不适症状[10]。吉法酯(Gefarnate)是一种促黏蛋白分泌剂，不但做为胃黏膜保护剂在临床上得到广泛使用[11]，而且对干眼症也有一定的保护作用，Dota等[12]研究发现吉法酯可以增加结膜杯状细胞的数量及促进黏蛋白5AC(mucoprotein-5AC, MUC5AC)等黏蛋白分泌，恢复并保护泪膜的完整性，改善角膜表皮的损伤，当剂量高于0.3%时效果显著且未观察到明显副作用；Toshida等[13-14]研究发现吉法酯在兔结膜碱灼烧模型中也获得同样结果，但具体的保护机制尚不明确。吉法酯存在2种构型，即4Z构型和4E构型，市售吉法酯是这两种异构体的混合物，且4Z ∶4E≈30 ∶70[15]。本课题组前期建立了单一构型吉法酯的合成路线，并分别合成了两种单一构型吉法酯(纯度>98%)供本次研究使用[16-17]。因此，本研究通过使用蛋白印记分析法(Western blot)检测大鼠泪腺中活化的半胱氨酸蛋白3(Cleaved-Caspase 3)、B淋巴细胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、Bcl2关联的X蛋白(Bcl2-Associated X, Bax)、Bcl2相关的死亡促进蛋白(Bcl2-Associated death promoter, Bad)及基质金属蛋白酶9(Matrix Metallo Protein-9, MMP 9)的表达，采用免疫组织化学染色观察眼表MUC5AC及MMP-9的表达来探讨不同构型吉法酯对干眼症大鼠的保护机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 40只雌性Wistar大鼠，6周龄，体质量160～180 g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司。在各12 h明暗周期、湿度40%～50%的22 ℃饲养室适应性饲养1周。

1.1.2主要药物和试剂 4Z构型和4E构型吉法酯由贵州医科大学药物化学重点实验室汤磊教授课题组制备，纯度大于98%；RIPA裂解液和彩虹广谱蛋白marker(北京索莱宝)，鼠单克隆抗体Bax、Bad及Bcl2(美国Santa)，兔单克隆抗体Cleaved-Caspase 3(美国CST)，荧光二抗兔抗和鼠抗(英国Abcam)，β-Actin、GAPDH、MMP9、MUC5AC抗体及SA1022免疫组织化学染色试剂盒(武汉博士德)，脱脂奶粉(北京博奥拓达)，SDS-PAGE凝胶试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒及PMSF(上海碧云天)，ZLI-9018DAB显示试剂盒(北京中杉金桥)。

1.1.3主要仪器 Odyssey CLx近红外荧光成像仪(美国Gene)，SDS-PAGE电泳仪(德国BioRaid)，NIKON TS100倒置相差显微镜(日本Nikon)，P70D20N1P-G5微波炉(广东格莱士)，手持匀浆机(北京天根生化科技)。

1.2方法

1.2.1干眼症动物模型的建立及分组 40只大鼠随机分为正常组、生理盐水组、4Z吉法酯治疗组(4Z组)、4E吉法酯治疗组(4E组)和混合吉法酯治疗组(4Z ∶4E=30 ∶70，混合组)，每组8只。除正常组外，其余组大鼠建立干眼症模型，即皮下注射6 g/L东莨菪碱氢溴酸盐，4次/d，0.5 mL/次，持续28 d，同时采用风扇联合除湿机模拟高流通性、低湿度(相对湿度为30%～40%)的环境，其中4Z组、4E组及混合组分别使用10 g/L的各构型吉法酯滴眼液治疗，生理盐水组用同体积的生理盐水滴眼，5次/d(9、11、13、15及17点)，每只眼睛20 μL/次，连续治疗2周。正常组大鼠置于正常环境饲养。

1.2.2取材 治疗14 d后冰上断颈处死大鼠，迅速取出泪腺和眼球。眼球固定于Bouin氏固定液保存于4 ℃，泪腺保存于-80 ℃。固定72 h后眼球进行常规梯度乙醇脱水、石蜡包埋处理，平行于眼轴作6 μm连续切片；-80 ℃冰箱取出泪腺组织，加入400 μL RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)后剪碎组织，在冰上使用手持匀浆机研磨成浆后冰上静置1 h，3 340 r/min，4 ℃离心30 min，吸取上清液保存于-80 ℃备用。蛋白定量后加入蛋白上样缓冲液，95 ℃水浴5 min后蛋白保存于-20 ℃。

1.2.3免疫组织化学 组织切片常规梯度乙醇脱蜡至水后，按照免疫组织化学试剂盒说明书步骤进行抗原修复，封闭后甩干不洗，加入相应一抗与组织切片4 ℃孵育过夜，第2天PBS清洗后与亲和素标记山羊抗兔IgG和HRP-标记山羊抗兔IgG孵育，显微镜下DAB显色，当组织呈现棕色即阳性显色反应时洗去DAB，苏木素复染后脱水封片，200倍显微镜下观察MMP9和MUC5AC的表达。

1.2.4Western blot 按SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书制备相应浓度分离胶和上层胶，各组蛋白按60 μg上样(Cleaved-Caspase 3上样量为120 μg)。转膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃与相应一抗孵育过夜，第2天孵育二抗后使用Odyssey CLx近红外荧光成像仪进行曝光，拍摄β-Actin、GAPDH、Cleaved-Caspase 3、Bax、Bad、MMP9及Bcl2蛋白的表达。

1.3统计学分析

蛋白质的灰度值、免疫组织化学阳性面积统计均使用Image J V1.8.0软件，使用SPSS 22.0软件对数据进行分析，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1眼表黏蛋白表达

与生理盐水组相比，4Z、4E和混合组大鼠眼表上皮细胞的MUC5AC表达均增加(P<0.05或P<0.01)，且4E组和混合组分别高于4Z组(P<0.05)。见图1。

注：与生理盐水组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)与4Z组比较，P<0.01。

2.2眼表和泪腺炎症因子MMP-9表达

与生理盐水组相比，4Z、4E和混合组大鼠眼表和泪腺中MMP-9的表达均降低(P<0.05或P<0.01)，且4E组在眼表和泪腺中均低于4Z组(P<0.05)，但混合组大鼠仅泪腺中MMP-9的表达低于4Z组(P<0.05)。见图2和图3。

注：(1)与生理盐水组比较，P<0.01；(2)与4Z组相比，P<0.05。

注：(1)与生理盐水组比较，P<0.05；(2)与4Z组相比，P<0.05。

2.3泪腺Cleaved-Caspase3、Bax及Bad蛋白表达

4Z、4E和混合组大鼠泪腺Cleaved-Caspase3、Bax及Bad蛋白表达较生理盐水组减少，Bcl-2蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01)；与4Z组相比，4E组大鼠泪腺中Bcl-2的表达增加，Cleaved-Caspase3、Bax及Bad表达减少，而混合组仅Bcl2表达增加和Cleaved-Caspase3表达减少(P<0.05或P<0.01)。见图4。

3 讨论

在干眼症的发病机制中，细胞凋亡起着重要的作用，已有研究显示干眼症患者结膜组织上皮细胞中发现转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表达增高，导致细胞凋亡指数上升，促凋亡因子与致炎因子表达的增加激活凋亡通路[18]；狗干眼模型中发现凋亡标志物p53的存在，同时在泪腺中发现Bcl2蛋白和凋亡诱导因子Bax的失衡能导致凋亡率上升[19]。在凋亡过程中，Caspase家族起着重要的作用，已在多个干眼症模型中发现Caspase家族的身影[20]。本研究利用蛋白免疫印迹法对泪腺中与凋亡相关的蛋白Caspase 3、Bax、Bad及Bcl2进行检测，结果表明经过各种构型吉法酯的治疗后，与生理盐水组相比，Bax、Bad及Caspase 3在泪腺中的表达量明显下调(P<0.05)，Bcl 2表达量明显上调(P<0.05)，且4E组对这些蛋白的调控作用明显优于4Z构型，而混合组仅Bcl2表达增加和Cleaved-Caspase3表达减少。这指示在对干眼症大鼠的保护作用中，抑制泪腺细胞凋亡方面，吉法酯通过抑制泪腺细胞的凋亡保护干眼症大鼠，且4E构型的保护作用优于4Z构型。

注：与生理盐水组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01；与4Z组相比，(3)P<0.05，(4)P<0.01。

炎症在近年干眼症的研究中已被多次证明，在干眼患者的眼表、泪腺和连接神经的整合系统出现大量淋巴细胞浸润，炎性介质和炎性细胞因子的显著增多，同时发挥抗炎作用的乳铁蛋白分泌显著减少[4-5]。炎症既是改变干眼病理的诱因，同时也是病变进一步发展的结果[21]。本次实验通过Western blot检测泪腺中MMP9的表达，发现与生理盐水组相比，经吉法酯治疗后，4Z、4E和混合组泪腺和眼表中发现少MMP9表达(P<0.05)，且4E组及混合组MMP9在眼表和泪腺中的表达水平明显低于4Z组。这提示吉法酯能通过抑制干眼症大鼠的泪腺及眼表的炎症保护干眼症大鼠，且4E吉法酯的保护作用优于4Z吉法酯。

近年来，结膜杯状细胞的缺失导致黏蛋白分泌减少，进而引起泪膜不稳定已引发学者们的关注[21]。眼表上皮细胞分泌产生膜结合型黏蛋白，与分泌性黏蛋白形成保护、润滑眼表的亲水性屏障，分泌性黏蛋白包括可溶性与形成凝胶的MUC5AC，有助于泪液的稳定性以及保持泪膜的亲水性[21]。本研究结果发现干眼症大鼠的眼表MUC5AC表达明显下降，各构型吉法酯能明显增加眼表MUC5AC的表达量，且4E组多于4Z组(P<0.05)。

综上所述，本次研究结果表明各构型吉法酯可以增加干眼症大鼠眼表MUC5AC的表达，减少泪腺中Cleaved-Caspase 3、Bax、Bad、Bcl及MMP-9的表达，且4E构型吉法酯和混合式吉法酯优于4Z构型吉法酯。