BRCA2蛋白表达与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系*

孙紫君，杨宇石，黄瑾瑾，冉立，毛大华，钟愉，徐澍*

(贵州医科大学附属医院 病理科，贵州 贵阳 550004)

乳腺癌是全球范围内发病率第一位的女性恶性肿瘤[1]。研究表明，乳腺癌易感基因2(breast cancer suscepblilty gene 2，BRCA2)与乳腺癌发生发展及其家族遗传性密切相关。BRCA2基因本质上是一种抑癌基因，通过参与同源重组介导的DNA修复达到抑制肿瘤发生发展的作用。因此，BRCA2基因突变的女性患乳腺癌的风险大大增加，并且其基因突变与乳腺癌的早期发病密切相关[2]。BRCA2基因突变往往是可遗传的，而遗传的BRCA2突变使携带者疾患早期发病的乳腺癌、卵巢癌和其他癌症的风险大大增加[3-4]。在BRCA2突变细胞中，DNA损伤修复反应被抑制，易导致出错的DNA修复增加，最终引起基因组稳定性降低[5]。BRCA2基因检测的相关研究已经成为乳腺癌及卵巢癌患者分子检测的重要组成部分和研究内容，研究发现的BRCA2的有意义突变仍然占少数，某些BRCA2突变并不影响蛋白表达及增加患者疾患乳腺癌的概率，对乳腺癌诊疗意义不大，而且成本较高[6]。本研究采用临床病理常用的免疫组化方法检测乳腺实体肿瘤中BRCA2蛋白的表达，分析其与患者临床病理特征的关系，探究BRCA2蛋白在乳腺实体肿瘤中的表达状况改变及其临床意义。

1 材料与方法

1.1临床资料

1.1.1对象 选取2008—2010年病理科97例乳腺浸润性导管癌患者蜡块组织为研究对象，选择同期30例癌旁正常乳腺组织作为对照；收集存档切片，由2位乳腺病理专业的主任医师双盲法根据《WHO(2012版)乳腺病理学和遗传学分册》诊断标准重新判读并分级[7]。乳腺癌分子分型依据最新标准：Luminal A(ER/PR阳性且PR>20%、HER-2阴性、Ki67<20%)，Luminal B样HER2阴性(ER/PR阳性、HER-2阴性且PR<20%、Ki67>20%)，Luminal B样HER2阳性型(ER/PR阳性、HER-2阳性)，HER2阳性型(ER和PR均阴性、HER-2阳性)，三阴性型(ER和PR均阴性、HER-2阴性)，所有HER-2阳性患者均行赫赛汀治疗。

1.1.2主要试剂 兔抗人单克隆抗体BRCA2一抗(博士德)，检测滴度为1 ∶50，一抗稀释液(碧云天)，二抗稀释液(碧云天)，二甲苯，无水乙醇，Mayer苏木素染液(索莱宝)，公司山羊血清，柠檬酸盐(均购于贵州永博鑫公司)，PBS粉剂(博士德公司)。

1.2方法 采用免疫组织化学方法检测BRCA2蛋白，BRCA2蛋白表达定位于细胞核，免疫组化结果由2位主任病理医师双盲法按照以下标准评分：高倍镜随机选取10个视野，计数1 000个乳腺癌细胞或正常乳腺腺上皮细胞，以阳性细胞数/1 000为阳性百分率，阳性百分率评分标准定为1分(1%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)。免疫组化结果评分(IRS)为强度和百分比的乘积，根据IRS评分将BRCA2染色分为阴性(IRS 0)、弱(IRS 1～4)、中度(IRS 6～8)和强(IRS 9～12)，将免疫组化≤8分判读为低水平表达组、≥9分者为高水平表达组[8]。

1.3统计学方法

收集97例乳腺浸润性导管癌患者临床病理特征(年龄、肿瘤大小、分子分型、月经情况、病理分级、淋巴结转移及TNM分期)，使用χ2检验方法分析癌组织中BRCA2蛋白表达与临床病理特征的关系，P<0.05表示差异有统计学意义。使用Kaplan-Meier-Meier和Longranktest统计学方法，分析不同水平的BRCA2表达与患者无进展生存时间(PFS)和总体生存时间(OS)的对比。

2 结果

2.1BRCA2蛋白在乳腺组织及乳腺癌中的表达

正常乳腺组织中BRCA2高水平表达率为90%，乳腺浸润性导管癌中高水平表达率为69.1%，BRCA2蛋白在正常乳腺组织中高水平表达高于乳腺浸润性导管癌，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2BRCA2表达与临床病理学特征的关系

结果显示，癌组织中BRCA2蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、分子分型、月经情况、病理分级、淋巴结转移及TNM分期无关，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

正常乳腺组织 浸润性导管癌

表1 乳腺癌组织中BRCA2表达与患者临床病理特征的关系

2.3BRCA2表达与复发转移之间的关系

BRCA2表达与复发转移差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4BRCA2表达与乳腺癌预后的关系

结果显示，癌组织中BRCA2蛋白表达与患者PFS及OS有关(P=0.049、0.036)。见图2。

图2 BRCA2表达与患者PFS及OS的关系

3 讨论

肿瘤的发生是一个多步骤的过程，引发肿瘤的往往是调节基因组完整性、细胞分裂和死亡基因的多种突变。细胞基因组的完整性受DNA损伤信号和DNA修复机制的密切调控。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2与乳腺癌和卵巢癌发展的关系在20多年前就已经得到证实[9]。BRCA基因突变就与基因组不稳定和许多恶性肿瘤发病率增加有关[10-11]。基因组不稳定性是正常细胞向肿瘤细胞转化和肿瘤进一步恶化的动力。BRCA基因属于毛细血管扩张性共济失调突变(ataxia-telangiectasia mutated ATM)介导的DNA DSBs修复信号通路家族，在维护基因组完整性方面发挥重要作用[12-13]。其中，BRCA2基因的有害突变可能导致DNA损伤的积累，使女性携带者更易患乳腺癌和卵巢恶性肿瘤，通常在绝经前发生[14]。BRCA2突变对乳腺癌的组织学病理状态、分期和分级，淋巴结转移均有影响，是决定乳腺癌预后和生存率的因素[15]。总的来说，与其他基因突变携带者相比，BRCA2的携带者表现出更高的肿瘤分期、分级和ER表达阴性，并表现出更多的血管侵犯[16]。在一项针对日本乳腺原位癌患者的基因研究中发现，BRCA2基因突变引发的肿瘤是常是中或低分化的。BRCA2基因突变携带者和非携带者之间的组织学等级没有显著差异。但是与非携带者相比，BRCA2基因突变的患者常表现为2级或3级。BRCA2突变对于乳腺癌的患病率本身没有显著影响，但是BRCA2基因突变的患者发病年龄显著提前[17]。

BRCA2(13q12.3，染色体13:碱基对32、315、479～32、399、671)是一种大的3 418个氨基酸蛋白。它包含27个外显子，覆盖了大约84.2 kb的基因组DNA[18]。在n端BRCA2包含一个转录激活域(TAD)。中间部分由外显子11编码，包含8个与RAD5126结合的被称为BRC重复序列的保守基序。一个DNA结合域位于BRCA2蛋白的羧基端，由保守的螺旋结构域、3个寡核苷酸结合折叠(OB)和一个(T)结构域组装而成，有利于BRCA2结合双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)。BRCA2的C端包含两个NLS和一个TR2结构域。时至今日，已经在BRCA2中发现了1 800多个突变。这些突变主要包括移码插入、缺失和无义突变，导致早期截断或非功能蛋白产生。BRCA2基因突变不仅容易导致乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌，还与恶性皮肤和眼部黑色素瘤、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌有关[19-22]。

BRCA2蛋白通过同源重组完成精确的DNA损伤后修复过程，在维持基因组完整性方面发挥着至关重要的作用。BRCA2蛋白功能的丧失可导致基因组不稳定，使得DNA损伤在细胞中不断堆积，最终导致非致瘤细胞转化为肿瘤启动细胞或肿瘤干细胞(CSCs)并且向进一步的肿瘤进化。研究表明，即使是同一肿瘤内的癌细胞，其引发肿瘤的能力，在程度上有很大的不同。CSCs群体具有长期的自我更新能力，并具有分化为其他肿瘤细胞类型和启动肿瘤生长的潜力[23]。鉴于CSCs具有广泛的自我更新和克隆潜能，再加上肿瘤细胞具有高度的基因组不稳定性，CSCs可能作为癌症进化的引擎发挥作用。因此，肿瘤内异质性依赖于CSCs的进化，这反映在新出现肿瘤克隆的数量上[24]。

本研究发现，正常乳腺组织中BRCA2高水平表达率为90%，乳腺浸润性导管癌中高水平表达率为69.1%，BRCA2蛋白在正常乳腺组织中高水平表达显著高于乳腺浸润性导管癌(P<0.05)。说明BRCA2蛋白可能通过促进DNA损伤修复对乳腺组织起保护作用,BRCA2蛋白的表达缺失可能导致乳腺癌.BRCA2蛋白与乳腺癌预后情况存在显著相关性，低水平表达时肿瘤预后较差(P<0.05)。综合本组实验结果及过往研究，BRCA2低水平表达与乳腺癌恶性生物学行为密切相关，其作用机制可能与BRCA2蛋白维持基因组完整性有关，当BRCA2蛋白低水平表达时，其促进DNA损伤修复的功能降低，基因组的稳定性和完整性遭到破坏，可能导致肿瘤的发生发展和肿瘤干细胞的形成。最终导致较差的预后。而BRCA2表达与年龄、肿瘤大小、分子分型、月经情况、病理分级、淋巴结转移、TNM分期及复发转移差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与本研究的病例有限有关。总而言之，BRCA2蛋白表达对乳腺浸润性导管癌预后的具有预测价值。