CD147和EGFR及HIF-1α在透明细胞肾细胞癌中的表达及意义

黄凇崧，何常，严瑞

(1.贵州医科大学附属医院 病理科，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学 临床医学院 病理学教研室，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学 临床医学院，肾内科教研室，贵州 贵阳 550004)

肾细胞癌是泌尿系统中常见的恶性肿瘤，占成人肿瘤的3%[1-2]。肾细胞癌源于肾小管上皮细胞，分为4个亚型，其中最常见的病理类型是透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，占肾癌总数的75%[3]。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellar matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN；cluster of differentiation 147，CD147)，其作用是介导细胞间及细胞间质间的粘附作用，通过多种途径刺激肿瘤细胞及周围间质成纤维细胞合成并释放基质金属蛋白酶，降解细胞外基质，促进肿瘤的转移和浸润[4]；表皮生长因子受体(epidermal growth factor recepter，EGFR)是ErbB受体家族的一员，广泛表达于细胞膜表面，与配体EGF结合后促进肿瘤细胞的增殖和生长[5]；缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被认为是肿瘤组织缺氧的内在标志，同时也是肿瘤细胞缺氧的调节因素[6]。以往的研究对CD147、EGFR及HIF-1α单一检测较多，对3者联合检测和相关关系探讨较少[4-6]。因此，本研究通过分析CD147、EGFR及HIF-1α在不同临床分期和病理分级的ccRCC标本和肾盂肾炎标本中的表达差异，探讨CD147、EGFR及HIF-1α在ccRCC中的表达及其与临床病理特征的关系，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源、主要试剂与仪器

1.1.1标本来源 收集2011年1月—2016年12月存档的诊断为ccRCC的手术切除肾脏标本为ccRCC组，同期慢性肾盂肾炎病理标本作为对照组，要求所有病例均经病理诊断证实，临床病理资料完整且术前均未行放、化疗及免疫治疗。最终纳入ccRCC组标本40例，年龄24～80岁、平均(56±18)岁，男24例、女16例，根据2002年美国癌症联合委员会肾癌分期标准Ⅰ～Ⅳ期分别有16例、21例、2例及1例，按Fuhrman病理分级标准Ⅰ～Ⅳ级分别有14例、24例、1例及1例；对照组标本20例，年龄38～72岁、平均(52±12)岁，男13例、女7例，包括肾及输尿管结石所致慢性肾盂肾炎16例，原发性慢性肾盂肾炎4例。

1.1.2主要试剂与仪器 鼠单抗CD147、鼠单抗EGFR、兔单抗HIF-1a及SP-9000二抗试剂盒(北京中杉金桥)，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB，DAKO公司)，0.2 mol/L磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、4%中性甲醛、二甲苯、0.5%盐酸酒精、1%碳酸锂及苏木素(德国merck)，石蜡切片(德国Leica公司)，BX517-32ETO型OLYMPUS正置显微镜及图像采集系统(日本OLYMPUS)。

1.2方法

1.2.1肾组织中CD147、EGFR及HIF-1α蛋白的表达 应用免疫组织化学链霉素抗生素蛋白-过氧化苯酶(streptavidin-perosidase，SP)法检测肾组织中CD147、EGFR及HIF-1α的蛋白表达，提取细胞或者组织中的特定化学物质，作为抗原或半抗原免疫兔子等实验动物，制备特异性抗体(一抗)，再用一抗作为抗原去免疫动物制备二抗，并用生物素或辣根过氧化物酶处理后与前述抗原成分相结合，将抗原放大，DAB显色，阳性部位显示棕黄色颗粒。CD147、EGFR及HIF-1α一抗浓度分别为1 ∶100、1 ∶100及1 ∶200，阴性对照片用PBS代替一抗，用已知为阳性的肾细胞癌为阳性对照。

1.2.2判读标准 所有切片采用双盲法，由2个病理医师分别阅片评分。CD147以细胞膜着色为阳性，EGFR以细胞浆着色为阳性，HIF-1α以细胞浆(核)着色为阳性。每张切片计数10个高倍视野所有细胞及阳性着色细胞数，计算阳性百分率。按阳性细胞百分率无、<30%、30%～70%及>70%分别计0、1、2及3分，再根据染色强度为无、浅黄色、黄色及棕黄色分别计0、1、2及3分；将以上2项得分相加作为最后判断结果，规定0分为“-”，1～2分为“+”，3～4分为“++”，5～6分为“+++”，最终将“-”和“+”计为阴性，“++”和“+++”计为阳性[7]。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，定量数据以均数±标准差表示；定性数据以频数、率或比(%)表示，组间差异采用χ2检验，表达强度与淋巴结转移、远处脏器转移和肿瘤分期之间的关系分析采用Kruskai-WallisH检验；P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CD147、EGFR及HIF-1α表达

结果显示，CD147以细胞膜着色为阳性，EGFR以细胞浆着色为阳性，HIF-1α以细胞浆(核)着色为阳性(图1)；ccRCC组CD147、EGFR及HIF-1α阳性表达率均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 ccRCC组和对照组CD147、EGFR及HIF-1α 的表达(SP)

表1 ccRCC组和对照组CD147、EGFR及HIF-1α 的表达[n(%)]

2.2ccRCC组CD147、EGFR及HIF-1α阳性表达级别与病理分级的关系

结果显示，随着病理分级加深，CD147、EGFR及HIF-1α的表达增强，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

2.3ccRCC组CD147、EGFR及HIF-1α阳性表达级别与临床分期的关系

结果显示，随着临床分期加深，CD147、EGFR及HIF-1α的表达增强，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表3。

2.4ccRCC组CD147、EGFR和HIF-1α表达的相关分析

ccRCC组CD147与EGFR的表达呈正相关(r=0.990，P=0.010)，CD147和HIF-1α 亦呈正相关(r=0.963，P=0.037), EGFR与HIF-1α呈正相关(r=0.987，P=0.013)。

表2 ccRCC组CD147、EGFR及HIF-1α阳性表达级别与病理分级的关系[n(%)]

表3 ccRCC组CD147、EGFR及HIF-1α阳性表达级别与临床分期的关系[n(%)]

3 讨论

ccRCC多位于肾脏皮质，实性多见，肿瘤与周围肾组织分界较清楚，可形成推压式边界和假包膜[8]。肿瘤呈金黄色或多彩状，含有脂质，部分可见囊腔、坏死、出血和钙化[9]。肿瘤细胞的转移和浸润是一个多步骤及多阶段的复杂过程，而在肿瘤细胞向邻近组织浸润和转移过程中基底膜细胞基质的降解是其中的必要阶段，肿瘤细胞的浸润和转移受肿瘤微环境各种因素的影响[10]。ccRCC病变形成过程中涉及癌基因和抑癌基因的表达失调[11-12]。

CD147是由269 个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白，相对分子量为45～55 kD，是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin super family，IgSF)的成员之一[13]，分子的N端呈高度糖基化[14]。本次研究结果表明CD147的表达与肿瘤的病理分级相关，呈正相关关系，肿瘤细胞的分化程度越低，肿瘤的恶性程度越高，CD147的表达强度就越强，提示肿瘤的分化一定程度上受CD147的影响[15-16]。本研究结果亦显示CD147的表达强度与临床分期呈正相关，表明CD147可以提示ccRCC的不良预后；对照组CD147的阳性表达率低于ccRCC组，差异有统计学意义(P<0.05)，并且组织分化程度越低，CD1147表达越强，这似乎提示CD147可能参与ccRCC的发生发展过程，可影响肿瘤的恶性程度及演进。

EGFR是一种受体酪氨酸激酶，具有酪氨酸激酶活性，属于ErbB 受体家族的成员，是细胞膜表面的糖蛋白受体，其相对分子量约为170 kD[14]。当EGFR与配体-EGF相结合，在EGFR酪氨酸激酶活性的作用下使酪氨酸残基磷酸化激活EGFR，从而促进肿瘤细胞的增殖和生长[14]。肿瘤中EGFR通过调节与肿瘤细胞生长和增殖相关的信号通路，促进肿瘤的发生、转移和侵袭，使肿瘤细胞表现出无限生长及增殖的特点[14]。本研究发现，在ccRCC中EGFR蛋白表达的阳性率为75%，EGFR在细胞膜或者胞浆混合表达结果没有临床病理意义，仅胞浆表达结果与肿瘤分级呈正相关关系。有学者发现，卵巢癌血清EGFR的过高表达预示着肿瘤患者治疗的预后不良[17]；有研究也表明EGFR在转移性非小细胞肺癌的突变率显著高于早期非小细胞肺癌，提示EGFR基因的突变影响着肿瘤的发生和发展，可通过预测 EGFR的突变率预估肿瘤的发展程度[18]；EGFR可以促进肿瘤血管的生成，从而增强肿瘤细胞的增殖能力，目前已经成为了肿瘤治疗的新靶点[17]。本研究结果亦显示，EGFR阳性表达于胞浆，在ccRCC中呈高表达，表达量与ccRCC临床分期呈正相关关系，表明EGFR可能参与ccRCC的发生与进展。

在常氧时，HIF-α的半衰期非常短，是因为脯氨酸羟化酶(pro1yl hydroxylase，PHD)能够识别其氧依赖降解区中两个特殊的脯氨酸残基并将其羟基化[19]。羟基化的HIF-α与肿瘤抑制蛋白(von Hippe1-Lindauprotein，pVHL)相结合，pVHL复合体通过聚集E3泛素连接酶，从而介导26S蛋白酶体对HIF-α的降解作用[20]；缺氧时，氧依赖降解区的PHD活性受到抑制，稳定的HIF-β亚基和HIF-α亚基形成二聚体，从细胞质穿到细胞核，最终连接到缺氧反应元件(hypoxia responsive，HRE)上启动靶基因转录[19-20]。肿瘤细胞在缺氧的微环境中能被诱导产生HIF-1α，反之，HIF-1α的阳性区能提示肿瘤组织存在缺氧部位[21]。肿瘤细胞对适应缺氧环境的办法之一就是提高糖酵解效率，另一个重要的办法就是形成多血管体系，使HIF-1α能够加强其下游靶基因，从而通过调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成影响肿瘤微血管的密度，促进肿瘤的生长及转移[21]。肿瘤细胞中低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)的活化还可以通过调节缺氧相关基因，如VEGF、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及趋化因子受体4(chemokine receptor4，CXCR4)等的表达，促进肿瘤间质上皮转化、肿瘤细胞增殖，从而维持肿瘤细胞的生存，是肿瘤发生发展的重要因素[22-24]。肾细胞癌为富含血管的实体肿瘤，实体肿瘤的生长、浸润和转移依赖于肿瘤新生血管的形成，而新生血管的形成又依赖于肿瘤血管生长因子[25]。本实验结果显示，HIF-1α在ccRCC组织高表达与病理分级和临床分期呈正相关关系。研究结果提示肿瘤的快速生长可导致肿瘤微环境呈缺氧状态，使HIF-1α表达增多且明显活化，帮助肿瘤细胞加快适应缺氧微环境，从而加速了肿瘤细胞的异质性和肿瘤血管生成，进而导致肿瘤侵袭力增强，患者预后差。

综上所述，CD147、EGFR及HIF-1α在ccRCC中高表达，且与肿瘤分期正相关，提示肿瘤血管生成增多可能是CD147、EGFR及HIF-1α共同作用的结果。